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Jul 26, 2023

Xuefu Zhuyu-Abkochung, ein traditionelles chinesisches Arzneimittel, bietet Neuroprotektion in einem Rattenmodell einer traumatischen Hirnverletzung über ein Anti

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 20040 (2016) Diesen Artikel zitieren 7472 Zugriffe 81 Zitate 2 Details zu altmetrischen Metriken Neuroinflammation ist von zentraler Bedeutung für die Pathologie des traumatischen Gehirns

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 20040 (2016) Diesen Artikel zitieren

7472 Zugriffe

81 Zitate

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Neuroinflammation ist von zentraler Bedeutung für die Pathologie traumatischer Hirnverletzungen (SHT). Xuefu Zhuyu-Abkochung (XFZY) ist eine wirksame traditionelle chinesische Medizin zur Behandlung von Schädel-Hirn-Trauma. Um seinen möglichen molekularen Mechanismus aufzuklären, zielte diese Studie darauf ab, zu zeigen, dass XFZY als entzündungshemmendes Mittel wirkt, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt. Sprague-Dawley-Ratten wurden kontrollierten kortikalen Einflüssen ausgesetzt, um eine neuroinflammatorische Reaktion hervorzurufen. Die Behandlungsgruppen erhielten XFZY (9 g/kg und 18 g/kg), die Vehikelgruppe und die Scheingruppe erhielten gleiche Volumina Kochsalzlösung per Magensonde. Zur Beurteilung neurologischer Defizite wurden der modifizierte neurologische Schweregrad-Score (mNSS) und der Morris-Wasserlabyrinth-Test verwendet. Der Gehalt an Arachidonsäure (AA) im Gehirngewebe wurde mittels Tandem-Gaschromatographie-Massenspektrometrie gemessen. TNF-α- und IL-1β-Spiegel im verletzten ipsilateralen Hirngewebe wurden mittels ELISA nachgewiesen. Die AKT- und mTOR-Expression wurde durch Western-Blot-Analyse gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass XFZY den Erwerb des räumlichen Gedächtnisses deutlich verbesserte. XFZY (insbesondere bei einer Dosis von 9 g/kg) reduzierte das mNSS und die Spiegel von AA, TNF-α und IL-1β deutlich. Nach der Verabreichung von XFZY (insbesondere bei einer Dosis von 9 g/kg) wurde eine signifikante Herunterregulierung der AKT/mTOR/p70S6K-Proteine ​​im Gehirngewebe beobachtet. XFZY könnte eine vielversprechende Therapiestrategie zur Reduzierung von Entzündungen bei TBI sein.

Schädel-Hirn-Trauma (TBI), eine intrakranielle Verletzung, die durch eine äußere Kraft verursacht wird, die die Schutzkapazität des Gehirns übersteigt, ist die häufigste Todes- und Behinderungsursache bei Menschen unter 45 Jahren1. Jährlich erkranken in den Vereinigten Staaten 5,3 Millionen Menschen an Schädel-Hirn-Trauma2. Davon benötigen 1,4 Millionen Menschen eine Notfallbehandlung und mehr als 235.000 einen Krankenhausaufenthalt3. In China ist der Anteil der Menschen mit schwerem Schädel-Hirn-Trauma, das hauptsächlich durch Verkehrsunfälle oder Stürze aus großer Höhe verursacht wird, viel höher als in anderen Ländern4. Es wird geschätzt, dass weltweit jährlich etwa 10 Millionen Menschen von Schädel-Hirn-Trauma betroffen sind5. Obwohl mehrere TBI-Therapien, wie Progesteron6, Minocyclin, Melatonin, Statine und mesenchymale Stammzellen3,7, in der Grundlagenforschung und frühen klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben, war bisher keine von ihnen in klinischen Phase-III-Studien erfolgreich8.

Die komplexe Pathogenese von TBI wird zunächst durch mechanische Schäden induziert, denen eine Reihe sekundärer Verletzungskaskaden folgen9. Im akuten und chronischen Stadium des Schädel-Hirn-Trauma wird die Neuroinflammation als Schlüssel zur Pathologie und Behandlung der Krankheit angesehen3,10,11. Neuroinflammation ist eine robuste, sterile Immunreaktion, die durch im Zentralnervensystem (ZNS) ansässige und peripher rekrutierte Entzündungszellen vermittelt wird12. Nach einer TBI tragen der Ausbruch reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und erhöhte Glutamatspiegel zu einer Entzündungsreaktion bei13,14, die das Ödem verschlimmert, indem sie die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke erhöht15. Darüber hinaus verhindert eine Entzündung die Nervenregeneration, indem sie die Bildung von Glia-Narben beeinflusst11,16. Darüber hinaus beeinträchtigt der pathologische Prozess das kognitive Gedächtnis, indem er die makromolekulare Synthese stört, die für die synaptische Plastizität erforderlich ist17. Die Entzündung, die durch Hirnkontusionen über pathophysiologische Mechanismen hervorgerufen wird, verursacht 60 % der Sekundärschäden18. Daher haben Behandlungen, die auf Neuroinflammation abzielen, als mögliche Behandlungen für TBI große Aufmerksamkeit erregt.

Arachidonsäure (AA (20:4ω6)) ist eine Vorstufe von Prostaglandinen (PGs) und Leukotrienen (LTs), die beide eine entzündliche Zellinfiltration induzieren19. Die ersten Responder während einer Entzündung sind polymorphkernige Leukozyten (d. h. Neutrophile), gefolgt von Monozyten, multipotenten Leukozyten aus dem Knochenmark, die sich in Makrophagen differenzieren20. Diese Entzündungszellen, die in den Bereich der Läsion rekrutiert werden, sezernieren mehrere Entzündungsfaktoren10,12. TNF-α ist das zentrale Zytokin, das die Entzündungsreaktion auslöst und reguliert21. IL-1β spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der zellulären Entzündungskaskade22. Darüber hinaus werden Mikroglia/Makrophagen, die nach einem Trauma im Hirngewebe vorhanden sind, aktiviert und verbleiben als M1-Phänotyp, der während der chronischen Phase hauptsächlich proinflammatorische Zytokine (z. B. TNF-α und IL-1β) produziert10. Anschließend ist es sinnvoll, AA, IL-1β und TNF-α als Ziele für die Beurteilung des Entzündungsgrades zu berücksichtigen.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Feinabstimmung der Entzündungsreaktion spielt23,24,25. PI3K-AKT-mTOR ist ein zentraler regelmäßiger Signalweg für Zellwachstum und Stoffwechsel, der verschiedene Umweltsignale integriert8,26. Zu Beginn eines Hirntraumas wird der AKT-mTOR-Signalweg im Gehirnparenchym aufgrund des reizbaren Gehirnstatus von TBI aktiviert27,28,29. AKT wird hauptsächlich durch die Modulation von vorgeschaltetem PI3K aktiviert und sein Phosphorylierungsgrad spiegelt indirekt die Konzentrationen an aktivem PI3K wider. Phosphoryliertes PI3K rekrutiert AKT und die 3-Phosphoinositid-abhängige Proteinkinase 1 (PDK1) an der Zellmembran und aktiviert AKT. Die Phosphorylierung von AKT stimuliert direkt mTOR, eine allgegenwärtige Serin-Threonin-Proteinkinase. Anschließend wird der mTOR-Signalweg im Gehirnparenchym aktiviert23,27,29, wo er die pro- oder antiinflammatorische Zytokinsynthese in Immunzellen24 wie Neutrophilen30, Makrophagen25 und Mikroglia23 moduliert. Der oben beschriebene aktivierte Signalweg führt zu einer erhöhten Produktion entzündungsfördernder Zytokine (z. B. TNF-α und IL-1β), um Neutrophile und Monozyten25,30 zu rekrutieren und Mikroglia zu aktivieren23. Die Hemmung des mTOR-Signalwegs ist in einzigartiger Weise dazu geeignet, die Produktion entzündungsfördernder Zytokine23,25,30,31 zu reduzieren und neurologische Verhaltensdefizite zu verbessern27,29,31.

Aufgrund der empirischen klinischen Praxis über viele Jahrhunderte hinweg und der Tatsache, dass aus der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) abgeleitete Wirkstoffe zahlreiche Angriffspunkte haben und nicht das Paradigma „Ein Wirkstoff/Ein Ziel“ für die Arzneimittelentdeckung verwenden32, deuten zunehmende Forschungsergebnisse darauf hin, dass die TCM ein potenziell wirkungsvoller Roman ist Arzneimittel. Xuefu Zhuyu-Abkochung (XFZY) ist eine alte TCM-Formel zur Behandlung von Herz-Hirn-Gefäßerkrankungen, einschließlich instabiler Angina pectoris33, ischämischer Herzkrankheit34, hypoxisch-ischämischer Hirnverletzung35 und postkraniozerebralen traumatischen psychischen Störungen36. Es wurde erstmals vor etwa 185 Jahren in dem Buch „Yilin Gaicuo“ von Qingren Wang in der späten Qing-Dynastie beschrieben. Damals bestand es aus 11 Rohkräutern: Prunus persica (L.) Batsch (Taoren), Angelicae sinensis (Oliv.) Diels (Danggui), Ligusticumi chuanxiong Hort. (Chuanxiong), Carthamus tinctorius L. (Honghua), Paeonia lactiflora Pall. (Chishao), Rehmannia glutinosa Libosch. (Dihuang), Citrus aurantium L. (Zhiqiao), Bupleurum chinense DC. (Chaihu), Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. (Jiegeng), Achyranthes bidentata Bl. (Niuxi) und Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao). Randomisierte kontrollierte Studien mit XFZY haben gültige Wirkungen bei Patienten mit TBI gezeigt36,37,38. Von XFZY abgeleitete Verbindungen, darunter Hydroxysaffflor Yellow A (HSYA) und Amygdalin, haben nachweislich die Fähigkeit, die Entzündungsreaktion zu kontrollieren39,40,41. Die oben genannten Beweise deuten auch darauf hin, dass der potenzielle Mechanismus der Neuroprotektion gegen TBI durch XFZY die Reduzierung der Entzündungskaskade umfassen könnte. Dennoch sind Einzelheiten zur pharmakologischen entzündungshemmenden Wirkung von XFZY bei TBI weiterhin unbekannt.

Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, zu untersuchen, ob XFZY eine entzündungshemmende Wirkung gegen TBI ausübt, indem es den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg hemmt, und Beweise für eine mögliche Rolle von XFZY als neuroprotektives Medikament für die Behandlung von TBI zu liefern (experimentelle Details). sind in einem Flussdiagramm in Abb. 1 dargestellt).

Flussdiagramm des Experiments.

Das Experiment wurde an sechs Gruppen durchgeführt: Vehikel, Schein, 9 g/kg XFZY, 18 g/kg XFZY, Schein 9 g/kg XFZY und Schein 18 g/kg XFZY. Das Dosierungsschema für jede Gruppe wurde kontinuierlich einmal täglich nach TBI angewendet. Die Qualitätskontrolle von XFZY wurde mit LCMS-IT-TOF durchgeführt. Am 1., 3., 7. und 14. Tag nach der TBI wurden 8 Ratten zufällig aus jeder Gruppe gezogen, mit Ausnahme der Schein-9-g/kg-XFZY- und der Schein-18-g/kg-XFZY-Gruppe. Nach den neurologischen Funktionstests wurden die Nagetiere dann zur Probenentnahme geopfert. Gehirnproben wurden für biochemische Tests und die Bestimmung der Arachidonsäure mittels GC-MS verwendet. Die verbleibenden 12 Ratten in jeder der oben genannten Gruppen wurden untersucht, um die neurologischen Funktionswerte am 1., 3., 7., 14. und 21. Tag nach TBI zu bewerten. Diese 12 Ratten in jeder Gruppe und 8 Ratten in jeder der Schein-XFZY-Gruppen (9 g/kg oder 18 g/kg) wurden vom 17. bis zum 21. Tag einem MWM-Test unterzogen.

Um die Qualität des in unserer Studie verwendeten XFZY (Abb. 2A) sicherzustellen, wurden HSYA und Amygdalin, die aus dem Monarch-Arzneimittel in der Verschreibung von XFZY stammen, als zentrale Verbindungen verwendet. Sie wurden als Qualitätskontrollstandards für XFZY verwendet. LCMS-IT-TOF wurde mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Acetonitril zur Trennung durchgeführt. Für die quantitativen und qualitativen Analysen wurde gekoppelte Tandem-Massenspektrometrie verwendet. Wie in Abb. 2 gezeigt, betrugen MS1 ​​und MS2 von Amygdalin m/z 458,16 (Abb. 2C) bzw. 296,11 (Abb. 2D). MS1 und MS2 von HSYA betrugen m/z 613,17 (Abb. 2E) bzw. 451,12 (Abb. 2F). Die Retentionszeiten von Amygdalin und HSYA in den LCMS-IT-TOF-Chromatogrammen von XFZY im positiven ESI-Modus betrugen 2,50 ± 0,02 min bzw. 3,48 ± 0,04 min (Abb. 2B). Die gesamten intra- und intertägigen Schwankungen von HSYA und Amygdalin betrugen weniger als 5 %. Die Methode war überprüfbar und lieferte eine gute Präzision. Als Genauigkeitstest wurde ein Wiederfindungstest durchgeführt und die Wiederfindung der beiden Analyten betrug >90 %. Die Ergebnisse zeigten, dass die Gehalte von zwei getesteten Verbindungen in XFZY wie folgt waren: HSYA, 0,942 ± 0,021 mg/g; Amygdalin, 0,107 ± 0,005 mg/g.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Ionenfalle und Flugzeit-Massenspektrometrie (LCMS-IT-TOF)-Analyse zur HSYA- und Amygdalin-Bestimmung, die aus dem Monarch-Medikament XFZY stammt.

(A) Zubereitete chinesische Kräutermedizin von XFZY in kleinen Mengen, die zum Abkochen bereit sind. (B) LCMS-IT-TOF TIC-Chromatogramme von XFZY im positiven ESI-Modus und chromatographische Profile von Amygdalin und HSYA. (C,D) MS1 und MS2 von Amygdalin betrugen m/z 458,16 bzw. 296,11. (E, F) MS1 und MS2 von HSYA betrugen m/z 613,17 bzw. 451,12.

Um zu untersuchen, ob die Behandlung mit Nach der CCI wurden neurologische Defizite zu vorgegebenen Zeitpunkten getestet, und die Behandlung mit Gruppe. Ratten, die mit 9 g/kg XFZY behandelt wurden, zeigten vom 3. bis zum 21. Tag weiterhin signifikante Verbesserungen im Vergleich zur Vehikelgruppe, während die Ratten, die mit 18 g/kg XFZY behandelt wurden, am 3. und 21. Tag eine signifikante Verbesserung zeigten Verbesserung der neurologischen Erholung im Vergleich zur Vehikelgruppe, wie sowohl durch mNSS- als auch ΔmNSS-Scores angezeigt. Darüber hinaus unterschieden sich die beiden XFZY-Gruppen in den folgenden Intervallen signifikant voneinander: 1–7, 1–14 und 1–21 Tage (Abb. 3B). Interessanterweise zeigten diese Ergebnisse, dass mit einer Behandlung mit 9 g/kg XFZY größere Verbesserungen der neurologischen Funktion erzielt wurden als mit einer Behandlung mit 18 g/kg XFZY.

Modifizierter neurologischer Schweregrad-Score (mNSS) nach Schädel-Hirn-Trauma oder Scheinverletzung oder Schädel-Hirn-Trauma mit XFZY.

(A) Die neurologische Funktion wurde durch mNSS nach einer Stunde zur Beurteilung der anfänglichen Behinderung sowie am 3., 7., 14. und 21. Tag nach TBI bewertet. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY senkte den mNSS am 3., 7., 14. und 21. Tag im Vergleich zur Vehikelgruppe signifikant. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY führte am 3. und 21. Tag zu einer signifikanten Abnahme (n = 8/Gruppe, Daten werden durch Zwei-Wege-ANOVA analysiert und als Mittelwert ± SEM dargestellt. p < 0,05 gegenüber der Vehikelgruppe) . (B) Veränderungen des mNSS (ΔmNSS) wurden in verschiedenen Zeitintervallen zwischen dem 1. Tag und mehreren vorgegebenen Zeitpunkten danach bewertet, wobei berücksichtigt wurde, dass die Leistung des mNSS am 1. Tag nicht signifikant war (mittlere mNSS-Werte: 9 g/kg XFZY-Gruppe). = 12,8 ± 0,4, 18 g/kg XFZY-Gruppe = 13,2 ± 0,4, Fahrzeuggruppe = 13,5 ± 0,5, alle p > 0,05 miteinander verglichen). Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY steigerte ΔmNSS signifikant über Zeitintervalle von 1–3, 1–7, 1–14 und 1–21 Tagen. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY erhöhte ΔmNSS im Zeitraum von 1–3 und 1–21 Tagen signifikant. Der ΔmNSS in der 9 g/kg XFZY-Gruppe stieg in den Zeitintervallen von 1–7, 1–14 und 1–21 Tagen im Vergleich zur 18 g/kg XFZY-Gruppe signifikant an (n = 12/Gruppe, Daten wurden mit RM analysiert). ANOVA und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05, #p < 0,01 gegenüber der Fahrzeuggruppe. ∆p < 0,05, □p < 0,01 gegenüber der 9 g/kg XFZY-Gruppe).

Der Morris Water Maze (MWM)-Test wurde mit scheinverletzten und CCI-Ratten durchgeführt, die mit Vehikel, 9 g/kg XFZY oder 18 g/kg XFZY behandelt wurden. Wir beobachteten einen signifikanten Effekt von CCI auf versteckte Plattformpfade (p < 0,01 für CCI im Vergleich zu Scheinverletzungen), indem wir eine gemischte Modell-RM-ANOVA zur Bestimmung des Verletzungsstatus (Schein versus CCI) und drei Behandlungsgruppen (9 g/kg XFZY, 18) verwendeten g/kg XFZY oder Vehikel) ohne Interaktion. Bei scheinverletzten Ratten führte die Behandlung mit 9 g/kg XFZY oder 18 g/kg XFZY zu keinen signifikanten Unterschieden in der Leistung im Test mit versteckter oder sichtbarer Plattform im Vergleich zur Vehikelbehandlung (Abb. 4A) oder Sondenversuchen (Abb. 4B). . Dieser Befund legt nahe, dass XFZY ohne Beeinträchtigung durch TBI keinen signifikanten Einfluss auf die kognitive Funktion hatte. Nach der CCI wurden signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet (P < 0,01) und Ratten, die mit 9 g/kg XFZY behandelt wurden, zeigten eine deutlich verbesserte Leistung in der versteckten Plattform (P < 0,05 gegenüber Vehikel) (Abb. 4C) und in Sondenversuchen (P < 0,01). 0,05 gegenüber dem Fahrzeug) (Abb. 4D). Eine signifikante Veränderung zwischen der 18 g/kg XFZY- und der Vehikelgruppe wurde jedoch nur im Sondenversuch beobachtet (Abb. 4D), ohne signifikante Unterschiede im Versuch mit versteckter Plattform (P > 0,05 gegenüber Vehikel) (Abb. 4C). Dieser Befund deutete darauf hin, dass die Behandlung mit 9 g/kg XFZY für die Behandlung der durch TBI verursachten kognitiven Beeinträchtigung vorteilhafter war als 18 g/kg XFZY.

Wirkung von XFZY auf kognitive Ergebnisse nach Scheinverletzung oder kontrollierter kortikaler Wirkung (CCI).

(A,B) Scheinverletzte Ratten (n = 8/Gruppe) wurden täglich mit 9 g/kg XFZY, 18 g/kg XFZY oder einer äquivalenten Menge Kochsalzlösung gefüttert. Der Morris Water Maze (MWM)-Test wurde dann vom 17. bis 21. Tag nach der Scheinverletzung durchgeführt. Die Leistung im MWM zeigte keine Unterschiede zwischen der verborgenen und der sichtbaren Plattform (p > 0,05 für Gruppen-ANOVA mit wiederholten Messungen (RM-ANOVA)) oder in den Sondenversuchen (p > 0,05, B), obwohl die Aufgabe gelernt wurde (p < 0,01). für zeitliche, versteckte und sichtbare Plattformtests). (C, D) In ​​den CCI-Gruppen (n = 12/Gruppe) wurden signifikante Gruppeneffekte in den Hidden-Platform-Tests beobachtet, um die Auswirkungen der XFZY-Behandlung (p < 0,01 für die Gruppe) beim Erlernen der Hidden-Platform-Paradigmen zu bewerten (S < 0,01 für die Zeit in jeder Gruppe). Die Ratten, die mit 9 g/kg XFZY behandelt wurden, schnitten in den Versuchen mit versteckter Plattform (p < 0,05) und Sonden (p < 0,05) deutlich besser ab als die mit Vehikel behandelten Mäuse. Obwohl es im Hidden-Platform-Test keine signifikanten Unterschiede gab, zeigte die 18 g/kg XFZY-Gruppe in den Sondenversuchen eine deutlich verbesserte Leistung im Vergleich zur Vehicle-Gruppe (p < 0,05). Es wurden keine Unterschiede in der sichtbaren Plattformleistung zwischen den CCI-Gruppen festgestellt (p > 0,05 für die Gruppe). *p < 0,05 im Vergleich zur Fahrzeuggruppe.

Als nächstes haben wir die AA-Werte in verletztem Hirngewebe sowohl quantitativ als auch qualitativ mithilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) bestimmt. Das m/z von AA betrug 67, 73, 75, 79, 91 und 117 (Abb. 5A). Die Retentionszeit in GC-MS-TICs von AA nach MeOx-TMS-Derivatisierung betrug 24,90 ± 0,02 Minuten (Abb. 5B). Der Gehalt an AA in den Gehirnproben wurde quantitativ anhand des Verhältnisses der Peakfläche zur authentischen Referenz-AA bestimmt. Trotz des allmählichen Rückgangs der AA-Spiegel im TBI-Gewebe stiegen die AA-Spiegel im ipsilateralen Hirngewebe vom 1. bis zum 14. Tag signifikant an. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY verbesserte den Anstieg der AA nach TBI während der gesamten Studie, während 18 g/kg kg XFZY war nur für kurze Zeit wirksam (Abb. 5C). Darüber hinaus wurde am dritten Tag eine signifikante Verringerung der AA im ipsilateralen Hirngewebe bei Ratten beobachtet, die 9 g/kg XFZY im Vergleich zu 18 g/kg XFZY erhielten (Abb. 5C).

Quantitative Bestimmung von Arachidonsäure (AA) in ipsilateralen Hirngeweben am 1., 3., 7., 14. und 21. Tag nach Schädel-Hirn-Trauma oder Scheinverletzung oder Schädel-Hirn-Trauma mit oraler Sondenernährung.

(A) GC-MS m/z von AA nach MeOx-TMS-Derivatisierung beträgt 67, 73, 75, 79, 91 und 117. Das obere Diagramm zeigt das Massenspektrum von AA in einer Gehirnprobe und das untere Diagramm zeigt das Massenspektrum von Standard-AA. (B) GC-MS-TICs von AA nach MeOx-TMS-Derivatisierung. (C) AA-Konzentration im Gehirngewebe am 1., 3., 7., 14. und 21. Tag nach der Verletzung. Der AA-Gehalt war in der Vehikelgruppe im Vergleich zur Scheingruppe vom 1. bis zum 14. Tag nach der Verletzung signifikant erhöht, wohingegen die Behandlung mit 9 g/kg XFZY die erhöhten AA-Werte im Vergleich zur Vehikelgruppe am 1. Tag signifikant reduzierte. 3., 7. und 14. Tag. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY reduzierte die erhöhten AA-Werte im Vergleich zur Vehikelgruppe am 1., 3. und 7. Tag deutlich. Am 3. Tag reduzierte die Behandlung mit 9 g/kg XFZY die AA-Spiegel im ipsilateralen Hirngewebe signifikant im Vergleich zur 18 g/kg XFZY-Gruppe (n = 8/Gruppe). Alle Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05, #p < 0,01 im Vergleich zur Fahrzeuggruppe. Δp < 0,05 gegenüber der 9 g/kg XFZY-Gruppe.

Um die entzündungsfördernden Faktoren TNF-α und IL-1β anzugreifen, die den Entzündungsstatus des Gehirns widerspiegeln, untersuchten wir die TNF-α- und IL-1β-Spiegel im ipsilateralen Gehirngewebe nach einer traumatischen Verletzung im Nagetiermodell von CCI. Die deutlich erhöhten TNF-α- und IL-1β-Spiegel blieben vom 1. bis zum 14. Tag nach der TBI im ipsilateralen Hirngewebe bestehen (Abb. 6). Der maximale TNF-α-Spiegel wurde am 3. Tag nach der TBI beobachtet (Abb. 6A) und die Spitzenwerte von IL-1β wurden am 1. Tag nachgewiesen (Abb. 6B). Die Verabreichung von XFZY (9 g/kg und 18 g/kg) hemmte den durch TBI verursachten Anstieg von TNF-α und IL-1β signifikant (Abb. 6), was darauf hindeutet, dass XFZY die Produktion entzündungsfördernder Zytokine modulierte. Überraschenderweise waren die umfassende Verbesserung der hochregulierten TNF-α-Spiegel (Abb. 6A) und die deutliche Hemmwirkung von 9 g/kg XFZY auf TNF-α (Abb. 6A) oder IL-1β (Abb. 6B) größer als diejenigen von 18 g/kg XFZY, was darauf hindeutet, dass 9 g/kg XFZY die proinflammatorische Reaktion wirksamer herunterreguliert.

Bestimmung der entzündungsfördernden Zytokinspiegel im Gehirngewebe.

(A) Die TNF-α-Spiegel in Gehirnlysaten jeder Gruppe. Die TNF-α-Spiegel waren in der Vehikelgruppe im Vergleich zur Scheingruppe vom 1. bis zum 14. Tag nach der Verletzung signifikant erhöht, wohingegen die Behandlung mit 9 g/kg XFZY den Anstieg von TNF-α im Vergleich zur Vehikelgruppe deutlich reduzierte der 1., 3., 7. und 14. Tag. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY reduzierte den Anstieg der TNF-α-Spiegel im Vergleich zur Vehikelgruppe am 1., 3. und 7. Tag signifikant (n = 8/Gruppe). Am 7. und 14. Tag waren die TNF-α-Spiegel in der XFZY-Gruppe mit 9 g/kg deutlich niedriger als in der XFZY-Gruppe mit 18 g/kg. (B) Die IL-1β-Spiegel in Gehirnlysaten in jeder Gruppe. Der IL-1β-Gehalt war in der Vehikelgruppe im Vergleich zur Scheingruppe vom 1. bis zum 14. Tag nach der Verletzung signifikant erhöht. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY reduzierte die erhöhten IL-1β-Spiegel im Vergleich zur Vehikelgruppe am 1., 3., 7. und 14. Tag signifikant. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY reduzierte die erhöhten IL-1β-Spiegel im Vergleich zur Vehikelgruppe am 1., 3., 7. und 14. Tag signifikant. Am 3. und 7. Tag reduzierte die Behandlung mit 9 g/kg XFZY die IL-1β-Spiegel im ipsilateralen Hirngewebe signifikant im Vergleich zur Behandlung mit 18 g/kg XFZY (n = 8/Gruppe). Alle Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert und werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05, #p < 0,01 im Vergleich zur Fahrzeuggruppe. ∆p < 0,05 gegenüber der 9 g/kg XFZY-Gruppe.

Um zu untersuchen, ob die entzündungshemmende Wirkung von oder CCI-behandelte-mit-XFZY-Ratten. Wir beobachteten eine deutliche Hochregulierung der AKT-Phosphorylierung im ipsilateralen Hirngewebe am 1. und 3. Tag nach TBI (Abb. 7B), ohne nennenswerte Veränderungen in der gesamten AKT-Expression (Abb. 7B). Analog wurde vom 1. bis zum 14. Tag eine erhöhte Phosphorylierung von mTOR beobachtet (Abb. 7D) und ging mit dem Fehlen bemerkenswerter Variationen in der Proteinexpression des gesamten mTOR einher (Abb. 7D). Die p70-ribosomale S6-Kinase (p70S6K), eines der wichtigsten Downstream-Ziele der mTOR-Signalisierung, war vom 1. bis zum 14. Tag nach TBI auch in der ipsilateralen Hemisphäre signifikant phosphoryliert (Abb. 7F). Es gab keine signifikante Veränderung der gesamten p70S6K-Expression. Die erhöhte Phosphorylierung von AKT/mTOR/p70S6K deutete darauf hin, dass der PI3K/AKT/mTOR-Signalweg im Post-TBI-Gehirn aktiviert wurde.

Die Auswirkungen von XFZY auf den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg nach TBI.

(A,B) Die p-AKT-Spiegel sanken am 1. und 3. Tag im ipsilateralen Hirngewebe nach TBI signifikant. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY reduzierte den Anstieg der p-AKT-Expression vom 1. bis zum 14. Tag im Vergleich zur Vehikelgruppe signifikant. Der gleiche Trend wurde in der 18 g/kg XFZY-Gruppe am 1., 3. und 14. Tag beobachtet. Die Expressionsniveaus von p-AKT waren in der 9 g/kg XFZY-Gruppe im Vergleich zur 18 g/kg XFZY-Gruppe am 7. und 14. Tag signifikant niedriger. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der gesamten AKT-Expression zwischen der Schein- und der Vehikelgruppe festgestellt. (C,D) p-mTOR war vom 1. bis zum 14. Tag nach TBI signifikant erhöht. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY verringerte die p-mTOR-Expression im Vergleich zur Vehikelgruppe vom 1. bis zum 14. Tag signifikant. Die Behandlung mit 18 g/kg XFZY reduzierte p-mTOR am 1. und 3. Tag signifikant. Die mTOR-Expression war in der 9 g/kg XFZY-Gruppe im Vergleich zur 18 g/kg XFZY-Gruppe am 1., 7. und 14. Tag signifikant reduziert. Im Vergleich zwischen den einzelnen Gruppen gab es keine signifikanten Veränderungen im Gesamt-mTOR. (E,F) p-p70S6K stieg vom 1. bis zum 14. Tag nach TBI signifikant an. Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY reduzierte die p-p70S6K-Expression an den oben genannten Tagen signifikant. Die gleiche Tendenz wurde in der 18 g/kg XFZY-Gruppe am 1. Tag beobachtet. Die p-p70S6K-Expression war in der 9 g/kg XFZY-Gruppe im Vergleich zur 18 g/kg XFZY-Gruppe am 3., 7. und 14. Tag signifikant reduziert. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der gesamten p70S6K-Expression zwischen der Schein- und der Vehikelgruppe festgestellt. Die Daten stellen das mittlere Verhältnis zwischen Targeting-Proteinen und β-Actin dar und werden als Prozentsatz der mit XFZY (oder Vehikel) behandelten Gehirne im Vergleich zu den mit Scheinbehandlung behandelten Kontrollgehirnen dargestellt. Die Daten stellen die mittlere Faltinduktion ± SEM dar, wie durch ANOVA analysiert. *p < 0,05, #p < 0,01 im Vergleich zur Fahrzeuggruppe. ∆p < 0,05, □p < 0,01 im Vergleich zur 9 g/kg XFZY-Gruppe.

Die Behandlung mit 9 g/kg XFZY verringerte die erhöhte Phosphorylierung von AKT/mTOR/p70S6K in der ipsilateralen Hemisphäre von TBI-Ratten während des gesamten Experiments dramatisch (Abb. 7B, D, F), während 18 g/kg XFZY gelegentlich eine ähnliche Hemmung ausübten AKT/mTOR/p70S6K-Phosphorylierung (Abb. 7B: p-AKT, am 1., 3. und 14. Tag; Abb. 7D: p-mTOR, am 1. und 3. Tag; Abb. 7F: p-p70S6K, am 1 Tag). Wir fanden auch heraus, dass 9 g/kg XFZY die Phosphorylierung von AKT/mTOR/p70S6K zu bestimmten Zeitpunkten deutlich reduzierten (Abb. 7B: p-AKT, am 7. und 14. Tag; Abb. 7D: p-mTOR, am 1.). , 7. und 14. Tag; Abb. 7F: p-p70S6K, am 3., 7. und 14. Tag). Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs nach der Behandlung mit 9 g/kg XFZY stärker war als nach 18 g/kg XFZY. Darüber hinaus gab es fast keine bemerkenswerten Unterschiede in der gesamten AKT/mTOR/p70S6K-Expression nach der Behandlung mit 9 g/kg oder 18 g/kg XFZY im Vergleich zur Vehikelgruppe, mit Ausnahme der verringerten Werte des gesamten AKT/p70S6K-Proteins als Reaktion darauf 9 g/kg XFZY am 1. Tag und die erhöhte Gesamt-AKT-Expression als Reaktion auf 18 g/kg am 14. Tag (Abb. 7B, F).

Die Entzündungsreaktion ist eine der Hauptursachen für Sekundärschäden sowohl in der akuten als auch in der chronischen Phase des Schädel-Hirn-Traumas, insbesondere bei Gehirnprellungen12,18. In dieser Studie wurde vor allem festgestellt, dass die Verabreichung von XFZY nach Schädel-Hirn-Trauma die Wiederherstellung neurologischer Defizite und eine Verbesserung der kognitiven Funktion erleichterte. Darüber hinaus wurde bei TBI-Ratten eine Umkehrung des Anstiegs der Expression von AA, proinflammatorischem Faktor (TNF-α und IL-1β) und Phospho-AKT/mTOR/P70S6K im ipsilateralen Hirngewebe beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass XFZY über entzündungshemmende Wirkungen, die aus der Hemmung des aktivierten PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs resultieren, einen signifikanten Neuroschutz gegen TBI bietet. Interessanterweise lieferte die klassische Dosis von XFZY (d. h. 9 g/kg bei Ratten), wie sie von Qingren Wang von „Yilin Gaicuo“ definiert wurde, bessere Heilwirkungen als die Ultra-Routine-Dosis (d. h. 18 g/kg bei Ratten), die wies darauf hin, dass die in der TCM verwendete klassische Dosis wissenschaftlich und vernünftig ist.

Eine Entzündung, die als zweischneidiges Schwert bekannt ist, besteht aus einer Anfangsphase, einer Dauerphase und einer Auflösungsphase. Adaptive Entzündungen sind hilfreich für die Gewebereparatur, wohingegen übermäßige Entzündungen direkt zu Sekundärschäden führen19. Arachidonsäure (20:4ω6), ein erstklassiger Eicosanoid-Vorläufer, wird durch eine Vielzahl von Enzymen auf einem stabilen zellulären Niveau gehalten. Im TBI-Modell werden Zellen als Reaktion auf ein mechanisches Trauma aktiviert, um überschüssige AA aus Membranlipiden freizusetzen, die durch Phospholipasen (PLA2) mobilisiert werden42. Anschließend wird AA in Säugetierzellen durch Cyclooxygenase-2 (COX-2) bzw. 5-Lipoxygenase (5-LO) zu Prostaglandinen und Leukotrienen metabolisiert19,42. Neuartige synthetische Prostaglandine wie Prostaglandin E2 (PGE2) und Prostacyclin (PGI2) tragen zur entzündlichen Infiltration bei, einschließlich des Austritts von polymorphkernigen Leukozyten (d. h. Neutrophilen) und Monozyten42. Das erzeugte Leukotrien B4 (LTB4) wird als entzündlicher chemotaktischer Wirkstoff aus der Zellmembran transportiert, um die entzündliche Zellaggregation zu stimulieren, die an bestimmten Stellen schädigende Wirkungen ausübt43. Die oben genannten Prozesse werden durch die Störung der Blut-Hirn-Schranke bei SHT verschlimmert. Darüber hinaus führen die reichlich vorhandenen Prostaglandine und Leukotriene, die aus AA stammen, direkt zu chronischen Entzündungen19. In der vorliegenden Studie hielt der Anstieg der AA im ipsilateralen Hirngewebe vom 1. bis zum 14. Tag nach TBI an und nahm im Laufe der Zeit allmählich ab (Abb. 5C), was durch die erhöhten AA-Serumspiegel gestützt wird, die in der metabolischen TBI-Studie beobachtet wurden von Shuguang Yang et al.44. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Entzündung mindestens bis zum 14. Tag nach der Schädel-Hirn-Trauma kontinuierlich anhielt. Glücklicherweise kehrte die Behandlung mit XFZY die erhöhten AA-Werte deutlich um und eine Dosierung von 9 g/kg war wirksamer als 18 g/kg.

Während einer Schädel-Hirn-Trauma können peripher abgeleitete Entzündungszellen eine neuroprotektive Wirkung entfalten oder im Laufe der Zeit maladaptive Sekundärverletzungsreaktionen verschlimmern. Zunächst werden rekrutierte Neutrophile, die sich im Bereich der Hirnschädigung befinden, aktiviert, um Metalloproteinasen, Proteasen, TNF-α und ROS12 freizusetzen, was die Rekrutierung von Monozyten im geschädigten Bereich20 sowie die Aktivierung von Makrophagen und Mikroglia45 weiter beschleunigt. Nach der Migration in den Bereich der Hirnläsion werden Monozyten, multipotente, aus dem Knochenmark stammende Leukozyten, zu Makrophagen, die mit der Efferozytose apoptotischer Granulozyten zusammenhängen19. Nach einer TBI werden Mikroglia, residente angeborene Gewebemakrophagen im ZNS, in den M1-Phänotyp umgewandelt. Dieser Phänotyp besitzt ein analoges Aussehen und eine ähnliche Funktionalität wie von Monozyten abgeleitete Makrophagen46, die durch eine entzündungsfördernde Reaktion und antimikrobielle Aktivitäten gekennzeichnet sind47. Darüber hinaus verschlimmern schädliche Substanzen, die beim Absterben von Neuronen oder Gliazellen freigesetzt werden, die sekundäre Schädigung und führen so zu einem Teufelskreis von Ereignissen. Diese pathophysiologischen Prozesse führen zu einer Vielzahl von Zytokinen, ROS, Purinen, Wachstumsfaktoren, erregenden Aminosäuren und schädigungsassoziierten molekularen Mustermolekülen (DAMPs)12, die im durch TBI induzierten hyperaktivierten Zustand eine vielfältige Gruppe von Signalwegen aktivieren können.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg nach TBI im Gehirnparenchym aktiviert wird27,28,29. AKT wird hauptsächlich durch die Modulation von vorgeschaltetem PI3K aktiviert und sein Phosphorylierungsgrad spiegelt indirekt die Konzentrationen an aktivem PI3K wider. Nach einer TBI aktiviert die Stimulation von BCR, TCR, Zytokinrezeptoren und Toll-like-Rezeptoren (TLRs) durch Signale, die als Reaktion auf ein Hirntrauma freigesetzt werden, Tyrosinkinase-Adaptermoleküle, die auf der Zellmembran vorhanden sind, um die p85-Untereinheit von PI3K zu rekrutieren trägt zur Aktivierung von PI3K bei, um die Umwandlung von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PIP3)24 zu katalysieren. PIP3 rekrutiert als Second Messenger AKT und PDK1 an die Zellmembran und phosphoryliert nachgeschaltete Ziele, einschließlich AKT. Folglich wird AKT von PDK1 aktiviert. Das phosphorylierte AKT führt zur direkten Aktivierung von mTOR durch das prolinreiche AKT/PKB-Substrat 40 kD (PRAS40) oder zur indirekten Aktivierung durch den Tuberkulose-Proteinkomplex (TSC) und das im Gehirn angereicherte Ras-Homolog (Rheb)8,48. mTOR, eine allgegenwärtige Serin-Threonin-Proteinkinase, reguliert verschiedene wichtige zelluläre Funktionen, die an der Transkription, dem mRNA-Umsatz, der Translation und der Proteinstabilität beteiligt sind. Die Regulation der Translation ist ihre am besten charakterisierte Funktion in Säugetierzellen49. Die p70-ribosomale S6-Kinase (p70S6K) ist ein Schlüsselsubstrat für die Steuerung des Verhältnisses der mRNA-Translation50. Obwohl in unserer Studie am 1. und 3. Tag nach TBI ein bemerkenswerter Anstieg der AKT-Phosphorylierung beobachtet wurde, war die Phosphorylierung von mTOR/p70S6K, den nachgeschalteten Zielen von AKT, bei mit CCI behandelten Ratten vom 1. bis zum 14. Tag signifikant erhöht ( Abb. 7), was darauf hindeutet, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg vom 1. bis zum 14. Tag in der verletzten ipsilateralen Hemisphäre aktiviert war. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass der aktivierte PI3K-AKT-mTOR-Signalweg zu einer erhöhten Produktion entzündungsfördernder Zytokine (z. B. TNF-α und IL-1β) und zur Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten führt25,30 aktivierte Mikroglia23.

Es ist offensichtlich, dass TBI eine verstärkte und anhaltende Neuroinflammation induziert, die sich negativ auf kognitive Prozesse und Verhaltensprozesse auswirkt. TNF-α sowie Anstiege von IL-1β wurden bei TBI und damit verbundenen unerwünschten Ereignissen beschrieben und können möglicherweise zu sekundären neuronalen Schäden führen51,52. Beide sind die wichtigsten Zytokine als Hauptregulatoren neuroinflammatorischer Prozesse nach TBI51,52. Eine Überproduktion von TNF-α und IL-1β bei chronischer Neuroinflammation nach TBI kann zur Störung synaptischer und plastischer Defizite der kognitiven Funktion beitragen1. Daher kann die Reduzierung erhöhter TNF-α- und IL-1β-Werte die neuronale Funktion wiederherstellen und kognitive Defizite nach TBI umkehren. In der vorliegenden Studie waren TNF-α und IL-1β im ipsilateralen Hirngewebe vom 1. bis zum 14. Tag nach TBI signifikant hochreguliert (Abb. 6). Darüber hinaus beobachteten wir maximale TNF-α- und IL-1β-Werte am 3. bzw. 1. Tag nach TBI. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein10,22. Die erhöhten Mengen an proinflammatorischen Zytokinen (z. B. TNF-α und IL-1β), die nach TBI im Gehirn freigesetzt wurden, führten zu einer Ausweitung der Sekundärschäden. Durch die Hemmung der Hochregulierung des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs wurde die Produktion entzündungsfördernder Zytokine (z. B. TNF-α und IL-1β) im Gehirngewebe drastisch unterdrückt23,31 und dieser Effekt ging mit Verbesserungen in der Post einher - Verhaltensdefizite bei Verletzungen, einschließlich neurologischer und kognitiver Funktionen23,28,49. Dieses Phänomen hängt möglicherweise mit einem der molekularen Mechanismen zusammen, die auf die Überproduktion von TNF-α und IL-1β bei Neuroinflammationen während TBI zurückzuführen sind. Überschüssiges TNF-α während einer Neuroinflammation trägt durch die Reduzierung postsynaptischer NMDAR-Ströme zu Defiziten in der kognitiven Funktion bei53, was durch die Fähigkeit der TNF-α-Synthesehemmung, die neuronale Funktion wiederherzustellen und durch Neuroinflammation verursachte kognitive Defizite umzukehren, weiter unterstützt wird53,54. Analog führte eine anhaltende Erhöhung der IL-1β-Spiegel im Hippocampus zu einer Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses55, während die Neutralisierung von IL-1β im CCI-Modell die kognitiven Ergebnisse verbesserte56. Ähnliche Ergebnisse wurden in unserer Studie nach der Behandlung mit XFZY (9 g/kg und 18 g/kg) beobachtet, das den aktivierten PI3K-AKT-mTOR-Signalweg durch Reduzierung der Phosphorylierungsniveaus von AKT/mTOR/p70S6K hemmte (Abb. 7). Dadurch wird die Überproduktion von TNF-α und IL-1β verringert (Abb. 6) und die Beeinträchtigung neurologischer Ergebnisse (Abb. 3) und des räumlichen Gedächtnisses (Abb. 4) gemildert. Die obigen Ergebnisse stützen die Spekulation, dass XFZY das Verhalten (neurologische oder kognitive Funktionen) erheblich verbesserte, indem es die Überproduktion entzündungsfördernder Zytokine durch Hemmung des aktivierten PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs unterdrückte.

Dies ist die erste Studie, die den neuroprotektiven Mechanismus aufklärt, der den entzündungshemmenden Wirkungen von XFZY in einem TBI-Rattenmodell zugrunde liegt (Abb. 8). XFZY kehrte die durch ein Trauma verursachten erhöhten AA-Werte um, was darauf hindeutet, dass die Rekrutierung von Entzündungszellen durch Prostaglandine oder Leukotriene in der Hirnverletzungsläsion verringert war. Die Hemmung des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs durch XFZY führte zu einer verringerten Produktion entzündungsfördernder Zytokine, möglicherweise aufgrund von Auswirkungen auf aktivierte Neutrophile, Monozyten, Mikroglia und/oder andere Faktoren im verletzten Hirnparenchym nach TBI. Die Wirkung von XFZY auf die Neutralisierung des Ungleichgewichts entzündungsfördernder Zytokine wirkte sich positiv auf die Verbesserung neurologischer und kognitiver Funktionen aus.

Entzündungsreaktion im Gehirn nach Schädel-Hirn-Trauma und der Pathomechanismus der entzündungshemmenden Wirkung von XFZY.

Nach einer TBI setzt die durch eine mechanische Verletzung stimulierte Zellmembran Arachidonsäure (AA) frei, die durch Cyclooxygenase-2 (COX-2) zu Prostaglandin E2 (PGE2) und Prostacyclin (PGI2) und durch 5-Lipoxygenase zu Leukotrienen (LTB4) metabolisiert wird (5-LO). Die drei Entzündungsmediatoren lösen eine akute Entzündung aus, einschließlich Veränderungen im Blutfluss, erhöhter Kapillarpermeabilität und der Rekrutierung von Entzündungszellen in der Ambituszone der Hirnverletzung, einschließlich polymorphkerniger Leukozyten (d. h. Neutrophile) und Monozyten. Überschüssige Prostaglandine und Leukotriene tragen zu chronischen Entzündungen bei. Die Neutrophilen werden aktiviert, um weitere chemotaktische Faktoren freizusetzen, nekrotisches Gewebe zu verschlingen und Bakterien zu sterilisieren. Der Zustrom von Monozyten und residenten Mikrogliazellen entwickelt sich zu Makrophagen, die entzündungsfördernde Faktoren (z. B. TNF-α und IL-1β) absondern und Fremdkörper, nekrotisches Gewebe oder apoptotische Zellen (z. B. Efferozytose) verbrauchen. XFZY unterdrückte die erhöhten Blut-AA-, TNF-α- und IL-1β-Spiegel im Gehirngewebe signifikant, was darauf hindeutet, dass XFZY entzündungshemmende Wirkungen besitzt. Um auf den PI3K-AKT-mTOR-Signalweg abzuzielen, kehrte XFZY die erhöhte Phosphorylierung von AKT/mTOR im Hirngewebe nach TBI sowie das nachgeschaltete p70S6K deutlich um, was zu einem verringerten Übersetzungsverhältnis von Entzündungsfaktoren und einer entzündungshemmenden Wirkung führte .

Bemerkenswert ist, dass der Neuroprotektionseffekt, der durch die klassische Dosis von die TCM-Verordnung, die auf langjähriger klinischer Praxis basiert, ist wissenschaftlich und sinnvoll. In der vorliegenden Studie wurden 9 g/kg als klassische XFZY-Dosis definiert, basierend auf dem Prinzip, dass die Dosis bei der Ratte 6,7-mal höher ist als die beim Menschen, wie in „Yilin Gaicuo“57 beschrieben. Wir haben die klassische Dosis (18 g/kg) als Ultra-Routine-Dosis verdoppelt, um die verschiedenen Heilwirkungen zu vergleichen. Dies sind die ersten Ergebnisse, die belegen, dass die klassische XFZY-Dosis hinsichtlich der Neuroprotektion gegen TBI vorteilhaftere Wirkungen hatte als die Ultra-Routine-Dosis. Diese Ergebnisse klären teilweise über eine optimale XFZY-Dosis für neuroprotektive Wirkungen auf, wenn man bedenkt, dass der XFZY-Komplex aus Tausenden von Verbindungen besteht und dass Änderungen der Dosis die Wechselwirkungen absorbierter Wirkstoffe in vivo gemäß der Multi-Target-Therapie beeinflussen können32. Die klassische Dosis liegt im Vergleich zur Ultra-Routine-Dosis möglicherweise nahe an der optimalen Dosis, Einzelheiten zum entsprechenden Mechanismus müssen jedoch in einer laufenden Studie noch weiter bestätigt werden.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass es sich bei XFZY um eine klassische TCM handelt, die Dutzende verschiedener chemischer Zusammensetzungen aufweisen kann, bleiben die absorbierten bioaktiven Zusammensetzungen von XFZY, die Schutzfunktionen im Gehirn ausüben, unklar. Darüber hinaus ist die Art und Weise, wie der aktivierte PI3K-AKT-mTOR-Signalweg in Entzündungszellen im Gehirnparenchym nach TBI gehemmt wurde, unbekannt. Weitere Forschung ist erforderlich, um die diesen Phänomenen zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.

Zusammenfassend übt XFZY eine neuroprotektive Wirkung aus, indem es die durch SHT verursachte Neuroinflammation neutralisiert und die Auswirkungen auf die neurologischen und kognitiven Funktionen nach der Verletzung durch Hemmung des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs lindert. Dies ist die erste Studie, die die Überlegenheit der klassischen Dosis von XFZY im Vergleich zu einer Ultra-Routine-Dosis zur Behandlung von Schädel-Hirn-Trauma unter dem Gesichtspunkt der entzündungshemmenden Wirkungswege bestätigt, die für die klinische Anwendung von XFZY zur Behandlung von Schädel-Hirn-Trauma wertvoller sind Patienten mit TBI. Die vorliegende Studie zeigte, dass XFZY eine potenziell vielversprechende Therapieoption für die Behandlung von TBI sein könnte.

Die Extrakte aus XFZY-Abkochung (Prunus persica (L.) Batsch, Carthamus tinctorius L., Angelicae sinensis (Oliv.) Diels, Rehmannia glutinosa Libosch., Achyranthes bidentata Bl., Paeonia lactiflora Pall., Citrus aurantium L., Glycyrrhiza uralensis Fisch ., Ligusticumi chuanxiong Hort., Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. und Bupleurum chinense DC. in einem Verhältnis von 8:6:6:6:6:4:4:4:3:3:2) wurden hergestellt für rohe pflanzliche Arzneimittel. Sie wurden in der Apotheke des Xiangya-Krankenhauses der Central South University, Provinz Hunan, VR China, gekauft. Jedes Kraut wurde vom Kräutermedizin-Botaniker Professor SY Hu an der Abteilung für chinesische Kräutermedizin der Central South University authentifiziert. Wir haben die Belegexemplare (Nr. 20140039) im Xiangya-Krankenhaus der Central South University (Changsha, China) aufbewahrt. Die elf Kräuter von XFZY mit den oben genannten Verhältnissen wurden verwendet, um ein lyophilisiertes Pulver von XFZY gemäß einem Standardverfahren zu erzeugen58. Schließlich wurde festgestellt, dass 1 g des lyophilisierten Pulvers 5,2 g rohe Kräuter enthielt. Es wurde bei 4 °C gelagert, bevor es zur Verwendung mit destilliertem Wasser gemäß dem Standard von 1 g/ml (w/v) aufgelöst wurde.

Das Shimadzu LCMS-IT-TOF-System (Tokio, Japan) wurde im Positivionenmodus mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) verwendet. Für die chromatographische Trennung wurde eine Shim-Pack XR-ODS (C18-Säule (2,0 mm Innendurchmesser × 75 mm, 1,6 μm, Shim) und 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B) mit einer Durchflussrate von 0,4 ml verwendet /min wurde verwendet, um die Gradientenelution festzulegen (17 % B für 0–2,0 Min., 17 %–35 % B für 2,0–3,0 Min., 35 %–44 % B für 3,0–7,0 Min., 44 %–55 % B für 7,0–9,0 Min., 55 %–60 % B für 9,0–14,0 Min., 60 %–63 % B für 14,0–17,0 Min. und 63 %–68 % B für 17,0–19,0 Min.) Die Säulentemperatur wurde auf 40 °C eingestellt C. Das Probeninjektionsvolumen betrug 5 μl. Die Detektionswellenlängen lagen im Bereich von 190 nm bis 800 nm. Die folgenden Parameter wurden für die analytische MS verwendet: Schnittstellenspannung, 4,5 kV; ESI-Spannung, 1,6 kV; Vernebelungsgas-Durchflussrate (N2), 1,5 l/min; Ionenfallendruck 1,8 × 10−2 Pa; Grenzflächentemperatur 200 °C; Trocknungsgasdruck 100 kPa; Ionenakkumulationszeit 30 ms. Für die kollisionsinduzierte Dissoziation wurde ultrahochreines Argon eingesetzt ( CID). Die oben genannte Standardlösung von 1 g/ml XFZY wurde 10 Minuten lang zentrifugiert (16.000 U/min, 4 °C). Die obere Schicht wurde durch einen 0,22-μm-Nylonfilter filtriert. Das Sickerwasser wurde zweimal mit destilliertem Wasser verdünnt und dann in das LCMS-IT-TOF injiziert.

Männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 g wurden vom Laboratory Animal Research Center der Central South University bereitgestellt. Sie wurden mindestens eine Woche lang unter Standardbedingungen gehalten und dann vor jedem Experiment 12 Stunden lang mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gefastet. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Central South University genehmigt und entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

Das Rattenmodell des Controlled Cortical Impact (CCI) wurde gemäß einem früheren Bericht mit einem elektronisch gesteuerten pneumatischen Schlaggerät (TBI 0310, Precision Systems & Instrumentation, Fairfax Station, VA) durchgeführt58. Die für dieses Gerät geforderten Parameter waren wie folgt: Einschlagtiefe: 5,0 mm von der kortikalen Oberfläche; Aufprallgeschwindigkeit: 6,0 m/s; Verweilzeit, 500 ms. Die Ratten wurden intraperitoneal mit 3 % Pentobarbital (50 mg/kg) anästhesiert. Unter sterilen Bedingungen wurde über dem Schädel ein Längsschnitt in der Mittellinie angelegt und mit einem tragbaren Bohrer und einem Trepan eine 5-mm-Kraniotomie über dem linken parietalen Kortex durchgeführt (das Zentrum der Koordinaten der Kraniotomie relativ zum Bregma: 1 mm posterior, 1 mm lateral) entfernt und der Knochenlappen entfernt. Die Ratten wurden dann in der TBI-Gruppe einer CCI unterzogen, wohingegen in der Scheingruppe kein Trauma der Großhirnrinde angewendet wurde. Die Kopfhaut wurde mit Cyanacrylat-Gewebekleber verschlossen. Während der gesamten Operation wurde die Körpertemperatur der Ratten überwacht und bei 37,0 ± 0,5 °C gehalten.

Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden die Ratten nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt: (1) Scheinoperiert (Schein, n = 44): Ratten, die sich dem CCI-Verfahren ohne Kortextrauma unterzogen und mit einer Sonde mit 0,9 % NaCl versorgt wurden; (2) TBI + Vehikel (Vehikel, n = 44): Ratten, die sich einer CCI unterzogen und die gleiche Menge Kochsalzlösung intragastrisch erhielten; (3) TBI + 9 g/kg XFZY (9 g/kg XFZY, n = 44): CCI-Ratten, die XFZY (9 g/kg) oral erhielten; (4) TBI + 18 g/kg XFZY (18 g/kg XFZY, n = 44): CCI-Ratten, die XFZY (18 mg/kg) oral erhielten; (5) Schein + 9 g/kg XFZY (Schein 9 g/kg XFZY, n=8): Ratten aus der Scheingruppe, die XFZY (9 g/kg) oral erhielten; (6) Schein + 18 g/kg XFZY (Schein 18 g/kg XFZY, n = 8): Ratten aus der Scheingruppe, die XFZY (18 g/kg) oral erhielten. Das Dosierungsschema für jede Gruppe wurde kontinuierlich einmal täglich nach TBI angewendet. Am 1., 3., 7. und 14. Tag nach der TBI wurden 8 Ratten zufällig aus jeder Gruppe gezogen, mit Ausnahme der Schein-9-g/kg-XFZY- und der Schein-18-g/kg-XFZY-Gruppe. Nach den neurologischen Funktionstests wurden die Nagetiere dann zur Probenentnahme geopfert. Die verbleibenden 12 Ratten in jeder der oben genannten Gruppen wurden untersucht, um die neurologischen Funktionswerte am 1., 3., 7., 14. und 21. Tag nach TBI zu bewerten. Diese 12 Ratten in jeder Gruppe und 8 Ratten in jeder der Schein-XFZY-Gruppen (9 g/kg oder 18 g/kg) wurden vom 17. bis zum 21. Tag einem MWM-Test unterzogen.

Nach der Durchführung durch zervikale Luxation wurden die ipsilateralen Hemisphären rasch entfernt. Nach dem Abspülen des Oberflächenbluts mit eiskalter 0,9 % NaCl wurden die Proben schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur biochemischen Untersuchung und Bestimmung von AA mittels GC-MS bei –80 °C gelagert.

Gehirnproben wurden gemäß Hongfei Yue et al.59 mit Modifikationen entnommen. Kurz gesagt wurden 20 mg Hirngewebestücke mit 200 μl Methanol und 2 μl Ameisensäure gemischt. Nach der Homogenisierung mit einem Homogenisator (TissueLyser LT, Deutsch) wurden die Gemische durch Zentrifugation geklärt. Die obere Schicht wurde in 1,8 ml destilliertem Wasser verdünnt. Der Überstand wurde auf die Festphasenextraktionskartuschen (SPE) Oasis®HLB (Maliford, MA, USA) geladen, die dann mit 3 ml destilliertem Wasser und 1 ml 10 % Methanol gewaschen und unter Vakuumbedingungen getrocknet wurden. Die erhaltenen Analyten wurden mit N2-Gas zur Trockne eingedampft. Der Trockenextrakt wurde aufgelöst und verwirbelt und die resultierende Mischung 1 Stunde lang konstant auf 70 °C erhitzt. Als nächstes wurden 100 μl N,O-Bistrimethylsilyltrifluoracetamid (BSTFA) und der Katalysator 1 % Trimethylchlorsilan (TMCS) zur Lösung gegeben. Schließlich wurde die gemischte Lösung erhitzt und zur GC-MS-Analyse in das GC-Mikrofläschchen umgeleitet.

Nach der Extraktion und Derivatisierung wurde 1,0 μl der Probenlösung in einem Aufteilungsverhältnis von 1:10 in ein GC/MS (Kyoto, Japan) injiziert. Die Säulentemperatur wurde 4 Minuten lang bei 70 °C gehalten und dann in Schritten von 1,0 ml/Minute auf 300 °C erhöht und 3 Minuten lang beibehalten. Die Injektionstemperatur wurde auf 280 °C eingestellt, wobei die Septumspülung mit einer Durchflussrate von 3 ml/min freigegeben wurde. Die Grenzflächentemperatur betrug 250 °C und die Temperatur der Ionenquelle betrug 200 °C. Als Trägergas wurde Helium mit einer Flussrate von 1 ml/min verwendet. Ein Elektronenstrahl von 70 eV wurde verwendet, um eine Ionisierung im Vollscanmodus (m/z 35–800) zu erreichen. Nach einer Lösungsmittelverzögerungszeit von 6 Minuten wurde die AA-Masse bei einer Detektorspannung von 0,9 kV im Vergleich zur Referenz-AA (St. Louis, MO, USA) unter Verwendung ähnlicher Massenspektren und Retentionszeiten identifiziert.

Die aufgetauten Gehirnproben wurden gewogen, präpariert und in 9 Volumina (1:9, w/v) eiskalter normaler Kochsalzlösung homogenisiert. Die Homogenate wurden 15 Minuten lang zentrifugiert (3.000 U/min, 4 °C). Die Überstände wurden verwendet, um den Gehalt an TNF-α und IL-1β gemäß den Anweisungen des Herstellers (CUSABIO, Wuhan, China) zu messen. Die Gewebeproteinkonzentrationen wurden mit der Bradford-Methode gemessen.

Ein exaktes Gewicht von 0,2 g Gehirngewebe wurde einmal in 0,1 M eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (BPS) eingetaucht. Nach dem Trocknen an der Luft wurde das Gewebe in 500 μl eiskalten RIPA-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren gegeben, um die Gewebehomogenate herzustellen. Nach 30 Minuten auf Eis wurden die Homogenate 5 Minuten lang zentrifugiert (12.000 U/min, 4 °C) und die Überstände gesammelt, um sie als Probenlösungen für die Western-Blot-Analyse zu verwenden, wie in einer früheren Studie beschrieben31. Es wurden ausreichend Probenlösungen entnommen, um die Gesamtproteinkonzentrationen mithilfe der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode zu messen. Die Membranen wurden mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: AKT (1:2.000; Cell Signaling Technology, Boston), Phospho-AKT (1:2.000; Cell Signaling Technology, Boston), mTOR (1:1.000; Cell Signaling Technology, Boston) , Phospho-mTOR (1:100; Cell Signaling Technology, Boston), Phospho-p70S6K (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Kalifornien), p70S6K (1:1.000; Cell Signaling Technology, Boston) und β-Aktin (1: 4.000; Santa Cruz Biotechnology, Kalifornien). Die Bandendichte wurde mit der Image J-Software quantifiziert. Das Ausmaß der Proteinexpression wird im Verhältnis zu den β-Actin-Spiegeln dargestellt.

Das mNSS wurde wie in einer früheren Studie60 beschrieben durchgeführt. Das mNSS umfasst eine Reihe zusammengesetzter Tests zur Bewertung der motorischen (Muskelstatus, abnormale Bewegung), sensorischen (visuell, taktil und propriozeptiv) und reflexiven Fähigkeiten anhand einer Reihe von Testaufgaben. Für die Nichterfüllung einer bestimmten Aufgabe oder für das Fehlen eines getesteten Reflexes wird ein Punkt vergeben. Ein höherer Wert deutet also auf eine schwerere Verletzung hin (Normalwert: 0; maximaler Defizitwert: 18). Nach dem Schädel-Hirn-Trauma wurde der mNSS am 1., 3., 7., 14. und 21. Tag beurteilt, um die Schwere der Verletzung zu bestimmen.

Kognitive Tests wurden in einem MWM wie zuvor beschrieben29 durchgeführt. Kurz gesagt, die Ratten wurden von einem der gleich weit entfernten Startorte aus, die bei jedem Versuch stochastisch verändert wurden, an die Wand angrenzend in den Tank gesetzt. Am 21. Tag wurde ein räumlicher Sondenversuch durchgeführt, um die Stärke der räumlichen Gedächtniserhaltung durch Entfernen der Plattform zu bewerten. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden die Ratten an derselben Startposition mit Blick auf die Wand platziert und dann 60 Sekunden lang frei im Becken ohne Plattform schwimmen gelassen, um die Zeit zu berechnen, die sie in der Zielquadrantenzone verbrachten, in der die Plattform positioniert war Erwerbsspuren, die den Grad der Gedächtniskonsolidierung anzeigen, die nach dem Lernen stattgefunden hat. Verhaltensparameter wurden mit dem Video-Tracking-System ANY-maze (Stoelting Co., USA) verfolgt und analysiert.

Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Analysen wurden mit dem Softwarepaket SPSS 11.0 oder Prism 5.0 (GraphPad) oder SAS-Software durchgeführt. Für mNSS wurde eine ANOVA mit wiederholten Messungen (RM ANOVA) eingesetzt. Für die statistische Analyse der MWM-Scores wurden das gemischte RM-ANOVA-Modell und die zweifaktorielle RM-ANOVA (Gruppe×Zeit) verwendet. Die verbleibenden biochemischen Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert.

Zitierweise für diesen Artikel: Xing, Z. et al. Xuefu Zhuyu-Abkochung, ein traditionelles chinesisches Arzneimittel, sorgt in einem Rattenmodell für traumatische Hirnverletzungen über einen entzündungshemmenden Weg für Neuroprotektion. Wissenschaft. Rep. 6, 20040; doi: 10.1038/srep20040 (2016).

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Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81303074, 81202781, 81403259 und 81303098), Science and Technology Plan Projects of Hunan Province, China (No. 2013SK3280) und People's Livelihood Support of Science and Technology Special Funds unterstützt aus Changsha, China (Nr. K1205018-31).

Labor für Ethnopharmakologie, Institut für integrierte traditionelle chinesische und westliche Medizin, Xiangya-Krankenhaus, Central South University, Changsha, 410008, China

Zhihua Xing, Zian Xia, Chunhu Zhang, Tao Tang, Jiekun Luo, Rong Fan, Weiping Liu, Xingui Xiong, Wei Huang und Yang Wang

Abteilung für traditionelle chinesische Medizin, 2. Xiangya-Krankenhaus, Central South University, Changsha, 410011, China

Weijun Peng & Chenxia Sheng

Abteilung für Innere Medizin bei Schilddrüsentumoren, Krebskrankenhaus der Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha, 410013, China

Jun Li

Abteilung für Pharmazie, Shaoyang Medical College Level Specialty School, Shaoyang, 422000, China

Chunyan Fu

Abteilung für Gerontologie und Atemwegserkrankungen, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, 410008, China

Yong Zou

Abteilung für Onkologie, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, 410008, China

Pingping Gan

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YW und ZHX haben die Studie entworfen und dabei geholfen, Unterstützung und Finanzierung zu koordinieren. ZAX führte die Recherche durch und verfasste das Manuskript. JL, CHZ, CYF und WJP nahmen an den Experimenten teil. TT, JKL, RF und WPL waren am Studiendesign beteiligt. XGX, YZ und PPG führten die statistische Analyse durch. WH, CXS und YW halfen beim Entwurf des Manuskripts. YW und ZAX haben das Papier überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xing, Z., Xia, Z., Peng, W. et al. Xuefu Zhuyu-Abkochung, ein traditionelles chinesisches Arzneimittel, sorgt in einem Rattenmodell für traumatische Hirnverletzungen über einen entzündungshemmenden Weg für Neuroprotektion. Sci Rep 6, 20040 (2016). https://doi.org/10.1038/srep20040

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Eingegangen: 01. Oktober 2015

Angenommen: 23. Dezember 2015

Veröffentlicht: 28. Januar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep20040

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