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Jun 02, 2023

Mycophenolsäure schützt Podozyten direkt, indem sie das Aktin-Zytoskelett erhält und das Zellüberleben erhöht

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4281 (2023) Diesen Artikel zitieren 749 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Mycophenolatmofetil (MMF) spielt eine etablierte Rolle als therapeutisches Mittel in

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 4281 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycophenolatmofetil (MMF) spielt eine etablierte Rolle als Therapeutikum beim nephrotischen Syndrom im Kindesalter. Während andere Immunsuppressiva nachweislich eine positive Wirkung auf Podozyten haben, sind direkte Auswirkungen von MMF auf Podozyten noch weitgehend unbekannt. Die vorliegende Studie untersucht die Auswirkungen des MMF-Wirkstoffs Mycophenolsäure (MPA) auf das Transkriptom von Podozyten und untersucht seine biologische Bedeutung. Wir führten eine Transkriptomik an kultivierten murinen Podozyten durch, die MPA ausgesetzt waren, um Hypothesen über podozytenspezifische Wirkungen von MPA zu erstellen. Dementsprechend haben wir die biologischen MPA-Effekte auf die Morphologie des Aktin-Zytoskeletts nach Behandlung mit Rinderserumalbumin (BSA) durch Immunfluoreszenzfärbung sowie auf das Zellüberleben nach Exposition gegenüber TNF-α und Cycloheximid durch Neutralrot-Assay weiter analysiert. Die MPA-Behandlung beeinflusste die Expression von 351 Genen in Podozyten signifikant (angepasster p < 0,05). Die Begriffsanreicherungsanalyse der Genontologie erfasste insbesondere Begriffe im Zusammenhang mit Aktin und entzündungsbedingtem Zelltod. Tatsächlich ergab die Quantifizierung des Aktin-Zytoskeletts von mit BSA behandelten Podozyten einen signifikanten Anstieg der Dicke und Anzahl der Aktinfilamente nach der Behandlung mit MPA. Darüber hinaus reduzierte MPA den durch TNFα und Cycloheximid verursachten Zelltod erheblich. MPA hat in vitro einen erheblichen Einfluss auf das Transkriptom von Podozyten, insbesondere einschließlich funktioneller Cluster, die mit nicht immunzellabhängigen Mechanismen zusammenhängen. Dies könnte eine molekulare Grundlage für direkte positive Auswirkungen von MPA auf die strukturelle Integrität und das Überleben von Podozyten unter entzündungsfördernden Bedingungen liefern.

Mycophenolsäure (MPA) ist der aktive Bestandteil des Prodrugs Mycophenolatmofetil (MMF). MPA wirkt als hochselektiver und wirksamer Inhibitor der Inosin-5′-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH), was zu einer Erschöpfung des Pools an Guanosintriphosphat (GTP) und Desoxy-GTP1,2 führt. Es wurde gezeigt, dass MPA die Typ-II-Isoform von IMPDH, die in aktivierten B- und T-Lymphozyten exprimiert wird, mit einer fünfmal höheren Affinität als die konstitutiv exprimierte Typ-I-Isoform bindet, was zu einer wirksamen Blockierung der Lymphozytenproliferation führt, während sie nur geringfügig ist Auswirkungen auf die Vermehrung anderer Zelltypen3,4. Dieser Wirkmechanismus, der zu einem vergleichsweise geringen Nebenrisikoprofil führt, hat zu einem breiten Einsatz von MMF im Bereich der Organtransplantation geführt, wo es sich als wirksames Medikament zur Vorbeugung einer akuten Abstoßung unter anderem von Nieren-Allotransplantaten erwiesen hat5. Darüber hinaus war MMF ein wichtiger Bestandteil der systemischen Lupus erythematodes-Therapie, insbesondere bei Patienten mit soliden Organmanifestationen wie Lupus Nephritis6. MMF wird auch in der kürzlich veröffentlichten KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases7 als glukokortikoidsparendes Mittel für das steroidsensitive nephrotische Syndrom empfohlen. Sein Einsatz bei der Behandlung der häufigsten Ursache glomerulärer Erkrankungen bei Kindern, dem idiopathischen nephrotischen Syndrom (INS), hat ständig zugenommen8. Trotz umfangreicher Forschung ist der Pathomechanismus des INS noch nicht vollständig aufgeklärt. Traditionell wurde INS als eine durch T-Lymphozyten verursachte Krankheit angesehen, doch die erfolgreiche Behandlung mit dem Anti-CD20-Antikörper Rituximab hat diese Sichtweise geändert9,10,11,12. Wichtig ist, dass es zunehmend Hinweise auf eine zentrale Rolle von Podozyten bei der Pathogenese von INS gibt. Podozyten sind terminal differenzierte Zellen, deren Fußfortsätze (FP) mit denen benachbarter Podozyten ineinandergreifen. Diese Verbindung bildet die äußere Schicht der glomerulären Filtrationsbarriere, das Schlitzdiaphragma (SD)13. Während einer Erkrankung unterliegt das Aktin-Zytoskelett dynamischen Veränderungen, wodurch die FP-Vernichtung induziert wird, was zu einer verringerten Druckkraft auf die glomeruläre Membran und folglich zum Verlust von Albumin und anderen Proteinen in den Urin führt14,15,16. Andere bei der Behandlung von INS eingesetzte Immunsuppressiva wie Glukokortikoide, Cyclosporin A und Rituximab wirken sich im Rahmen ihrer antiproteinurischen Wirkung positiv auf das Aktin-Zytoskelett von Podozyten aus17,18,19. Die Wirkung von MPA auf Nierenzellen ist kaum erforscht. Sowohl in In-vitro- als auch In-vivo-Experimenten wurde gezeigt, dass MPA die Proliferation von Mesangialzellen durch die Erschöpfung des Guanosinpools hemmt20,21. In Bezug auf Podozyten zeigte MPA eine konservierende Wirkung auf die Nephrinexpression in Adriamycin-induzierten Nephritis- und Diabetes mellitus-Modellen22,23. Im letztgenannten Modell war MPA in der Lage, die Apoptose der Podozyten durch eine Reduzierung der Bax- und gespaltenen Caspase-3 (CC3)-Proteinspiegel zu reduzieren. Die transkriptomische Analyse von Mäusenieren in einem Lupusnephritis-Modell zeigte einen Anstieg der Aktin-assoziierten Begriffe nach der Behandlung mit MMF24. In derselben Studie reduzierte MMF die Aktivierung von Rac1 in kultivierten Podozyten im Vergleich zu Kontrollen. Um unsere Erkenntnisse über die Wirkung von MPA auf Podozyten zu verbessern, wurden wir aufgefordert, direkte, nicht durch Immunzellen vermittelte Reaktionen weiter zu untersuchen, durch die MPA diese Zellen günstig beeinflussen könnte. Wir führten daher eine transkriptomische Analyse der mit MPA behandelten Podozyten durch und untersuchten anschließend die funktionellen Auswirkungen der entdeckten Veränderungen der mRNA-Spiegel.

Eine bedingt immortalisierte Maus-Podozyten-Zelllinie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Mundel) wurde auf mit Kollagen Typ I (A1064401 – Invitrogen) beschichteten Kulturschalen kultiviert und in RPMI-1640-Medium + GlutaMAX (#61870036, Gibco), ergänzt mit 10, aufbewahrt % fötales Rinderserum (FBS, 10270106 – Gibco), 1 % HEPES-Lösung (H0887 – Sigma) und 1 % Natriumpyruvat (S8636 – Sigma) bei 33 °C in Gegenwart von rekombinantem Maus-Interferon-\(\gamma\)( INF-\(\gamma\), #315–05, PeproTech), um die Verbreitung unter zulässigen Bedingungen zu ermöglichen. Anschließend erfolgte eine 10-tägige Inkubation bei 37 °C ohne zusätzliches INF-\(\gamma\), um die Differenzierung im nicht-permissiven Zustand zu induzieren, wie zuvor beschrieben25. Die Differenzierung wurde durch Synaptopodin-Färbung bestätigt (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden regelmäßig auf Mykoplasmen-Infektionen untersucht. Nach der Differenzierung wurden die Zellen 2 Stunden lang mit MPA (M3536 – Sigma-Aldrich) in einer Konzentration von 10 mg/L und anschließend 22 Stunden lang mit einer Konzentration von 4 mg/L behandelt. Die MPA-Konzentrationen wurden auf der Grundlage der Pharmakokinetik der MPA-Plasmakonzentrationen ausgewählt, die bei Kindern mit idiopathischem nephrotischem Syndrom gemessen wurden26. Zellen der Kontrollgruppe erhielten die entsprechende Menge Methanol als Vehikel (Abb. 1A).

Die Behandlung mit MPA führt zu Veränderungen im Transkriptom der Podozyten. (A) Bedingt immortalisierte Podozyten wurden differenziert, 24 Stunden lang entweder mit Vehikel oder Mycophenolsäure (MPA) behandelt und einer RNAseq-Analyse unterzogen. (B) Vulkandiagramm zur Visualisierung der Auswirkungen von MPA auf das Transkriptom von Podozyten. Blau, angepasster p-Wert (padj) < 0,05; rot, padj > 0,05. Die MPA-Behandlung führte zu 130 signifikant herunterregulierten und 221 signifikant hochregulierten Genen. (C) Gene wurden entsprechend ihrem Z-Score-Transformationswert in eine Heatmap sortiert, was zu vier Clustern führte. Cluster 1, rot, herunterregulierte Gene. Cluster 2, blau, stark herunterregulierte Gene. Cluster 3, grün, hochregulierte Gene. Cluster 4, orange, stark hochregulierte Gene. (B) Cluster wurden einer Gene Ontology (GO)-Term-Enrichment-Analyse unterzogen. Wichtige, deutlich angereicherte Begriffe werden für jeden Cluster zusammengefasst.

Die Zellen wurden gemäß Behandlungsprotokoll A (Abb. 1A) behandelt. Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNA-Extraktionskit von Zymo Research (R2052direct-zol RNA-miniprep) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert, die mRNA-Sequenzierung wurde im Kölner Zentrum für Genomik durchgeführt. Bibliotheken wurden mit dem Illumina® Stranded TruSeq® RNA-Probenvorbereitungskit vorbereitet. Die Bibliotheksvorbereitung begann mit 2 µg Gesamt-RNA. Nach der Poly-A-Selektion (unter Verwendung von Poly-T-Oligo-gebundenen Magnetkügelchen) wurde die mRNA unter Verwendung zweiwertiger Kationen bei erhöhter Temperatur gereinigt und fragmentiert. Die RNA-Fragmente wurden mithilfe von Zufallsprimern einer reversen Transkription unterzogen. Darauf folgte die Synthese des zweiten cDNA-Strangs mit DNA-Polymerase I und RNase H. Nach der Endreparatur und dem A-Tailing wurden Indexierungsadapter ligiert. Anschließend wurden die Produkte gereinigt und amplifiziert (14 PCR-Zyklen), um die endgültigen cDNA-Bibliotheken zu erstellen. Nach der Validierung und Quantifizierung der Bibliothek (Agilent Tape Station) wurden äquimolare Bibliotheksmengen gepoolt. Der Pool wurde mithilfe des Peqlab KAPA Library Quantification Kit und des Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System quantifiziert. Der Pool wurde auf einem Illumina NovaSeq6000-Sequenzierungsgerät mit einem PE100-Protokoll27,28 sequenziert.

Die Lesevorgänge wurden mit Trimmomatic (Version 0.36) unter Verwendung von Standardparametern getrimmt29. Darüber hinaus wurden bis zu zehn Basen geringer Qualität zu Beginn der Lesevorgänge entfernt. Die getrimmten Lesevorgänge wurden mit STAR Version 2.6.0 unter Verwendung von Standardparametern auf das GRCm39-Mausreferenzgenom abgebildet30. Die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit dem R-Paket DeSeq2 (Version 1.26.0)31,32 durchgeführt. Zur Visualisierung wurde der Batch-Effekt mit der Methode „removeBatchEffect“ aus dem R-Paket limma33 entfernt. Die Anreicherungsanalyse wurde mit dem R-Paket topGO34,35 durchgeführt. Für die Heatmap und das Clustering wurde das R-Paket pheatmap verwendet36. Die Z-transformierte Genexpression von Genen mit einem angepassten p-Wert (padj) < 0,05 (berechnet durch DeSeq2) im Vergleich MPA vs. Kontrolle wurde in der Heatmap visualisiert und geclustert.

Undifferenzierte Podozyten wurden auf Deckgläser ausgesät und wie oben beschrieben differenziert. Nach der Differenzierung wurden die Zellen in Medium mit fettsäurefreiem Rinderserumalbumin mit niedrigem Endotoxingehalt (BSA, A8806 – Sigma-Aldrich) in einer Konzentration von 50 mg/ml 48 Stunden lang inkubiert (BSA + Vehikel [veh]). Wir haben uns am Studiendesign von Yoshida et al.37 orientiert, die BSA-Konzentration jedoch angepasst, um ein robustes Verletzungsmodell zu erreichen, bei dem Typ-C- und Typ-D-Zellen vorherrschen. Die Behandlungsgruppe erhielt in der zweiten Hälfte der 48 Stunden eine zusätzliche MPA-Behandlung (BSA + MPA). Eine weitere Gruppe wurde nur mit MPA (MPA) behandelt. Zellen ohne BSA-Exposition und MPA-Behandlung dienten als Kontrollen (Abb. 2A). Die behandelten Zellen wurden dann mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, bevor sie 30 Minuten lang mit 5 % Normal Donkey Serum und 0,1 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) blockiert und permeabilisiert wurden. Auf Synaptopodin gefärbte Zellen wurden mit einem Synaptopodin-Antikörper (S9442 – Sigma-Aldrich, 1:500) über Nacht inkubiert, gefolgt von einer 60-minütigen Inkubation mit dem entsprechenden sekundären Antikörper bei Raumtemperatur (RT) (Alexa Fluor® 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit). IgG (H + L), 1:250). Auf Aktin gefärbte Zellen wurden mit fluoreszierend konjugiertem Phalloidin bei RT 60 Minuten lang inkubiert (647P1-33 – Dyomics, 1:50). Anschließend wurden die Deckgläser mit Prolong Gold und DAPI montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss Meta 710 aufgenommen und mit ImageJ verarbeitet. Für die quantitative Analyse von Aktinfaser-Assemblierungsmustern wurde ein zuvor beschriebenes Bewertungssystem angepasst und die Bilder wurden von einem Beobachter bewertet, der für die Zellbehandlung blind war38. Pro Probe wurden mindestens 90 Zellen analysiert. Die vier Gruppen, die die unterschiedlichen Muster der Aktinfaseranordnung beschreiben, wurden wie folgt definiert: Typ A: 90 % der Zellfläche mit dicken Kabeln gefüllt; Typ B: mindestens zwei dicke Kabel verlaufen unter dem Zellkern, der restliche Zellbereich ist mit feinen Kabeln gefüllt; Typ C: keine dicken Kabel, aber einige Kabel vorhanden; und Typ D: im zentralen Bereich der Zelle sind keine Kabel sichtbar (Abb. 2B).

MPA schützt das Aktin-Zytoskelett vor BSA-induzierten Schäden. (A) Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit Rinderserumalbumin (BSA) behandelt und erhielten in den zweiten 24 Stunden entweder MPA oder Vehikel. Das Aktin-Zytoskelett wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. (B) Quantifizierung verschiedener Zelltypen nach Behandlung mit Rinderserumalbumin (BSA) und Mycophenolsäure (MPA). Grau = Typ A: > 90 % der Zellfläche mit dicken Kabeln gefüllt; grün = Typ B: mindestens zwei dicke Kabel verlaufen unter dem Kern, der restliche Zellbereich ist mit feinen Kabeln gefüllt; gelb = Typ C: keine dicken Kabel, aber einige Kabel vorhanden; rot = Typ D: im zentralen Bereich der Zelle sind keine Kabel sichtbar. Die BSA-Behandlung verringert die Zahl gesunder Typ-A- und B-Zellen und erhöht gleichzeitig die Zahl weniger gesunder Typ-C- und D-Zellen. Eine zusätzliche MPA-Behandlung kehrt diesen Effekt in allen Kategorien um, indem sie im Vergleich zu BSA nur die Zellen vom Typ A und B erhöht und gleichzeitig die Zellen vom Typ C und D verringert. Die Behandlung nur mit MPA führte zu einer ähnlichen Verteilung der Zelltypen wie bei den Kontrollen. Pro Probe wurden mindestens 90 Zellen analysiert. (C) Quantifizierung von Typ-D-Zellen für jede Behandlung. Die Behandlung mit BSA erhöht die Anzahl der kabellosen D-Zellen deutlich. Im Gegensatz dazu verringert eine zusätzliche Behandlung mit MPA die Anzahl der D-Zellen signifikant im Vergleich zur Behandlung nur mit BSA **p < 0,01. (D) Repräsentative konfokale Bilder der Podozyten nach jeder jeweiligen Behandlung. Grün, Phalloidin. Blau, DAPI.

Die Zellen wurden in einer Kulturschale mit 96 Vertiefungen ausgesät und differenziert. Nach der Differenzierung wurde die Behandlungsgruppe 24 Stunden lang mit MPA vorbehandelt. Anschließend wurden die Zellen mit rekombinantem Maus-Tumornekrosefaktor-α (TNF-α; Recombinant Mouse TNF-alpha [aa 80–235] Protein, #410-MT, R&D Systems, 20 ng/ml), Cycloheximid (CHX; C4859, Sigma-Aldrich, 5 µg/ml) und MPA für weitere 24 Stunden (TCM). Wir verwendeten TNF-α in Kombination mit dem synergistisch wirkenden CHX, um eine hohe Anfälligkeit für Apoptose zu erreichen39,40. Zu den weiteren Behandlungsgruppen gehörten Zellen, die nur TNF-α und CHX (TC) erhielten, sowie Zellen, die TNF-α, CHX und einen Pan-Caspase-Inhibitor, Emricasan (SEL-S7775, Biozol) (TCE), erhielten41. Als Kontrolle dienten Zellen, die nur die Fahrzeuge aller jeweiligen Agenten erhielten. Eine zusätzliche Kontrollgruppe erhielt 48 Stunden lang (M) nur MPA. Die Behandlungspläne und Konzentrationen aller Wirkstoffe sind in Abb. 3A dargestellt. Während der letzten 2 Stunden der Behandlung wurde jeder Vertiefung Neutralrot zugesetzt. Als nächstes wurden die Zellen gewaschen und der Farbstoff mit einer Entfärbelösung (50 % EtOH, 49 % VE H2O, 1 % Essigsäure) aus lebensfähigen Zellen extrahiert. Die Absorption jeder Vertiefung wurde mit einem Spektrophotometer bei 540 nm gemessen. Die Menge lebensfähiger Zellen wurde als Verhältnis der Absorption jeder Vertiefung zur Absorption ihrer jeweiligen Kontrolle berechnet. Jede Bedingung wurde mit Tripletts von drei verschiedenen Passagen durchgeführt.

MPA erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen während des TNF-α- und CHX-induzierten Zelltods. (A) Die Zellen wurden 48 Stunden lang entweder mit Vehikel oder MPA (M) oder 24 Stunden lang mit Emricasan (E) behandelt. Alle Zellen erhielten 24 Stunden lang Tumornekrosefaktor-α (T) und Cycloheximid (C). Eine zusätzliche Kontrollgruppe erhielt 48 Stunden lang (M) nur MPA. Dies führte zu 5 Behandlungsgruppen (Kontrolle, TC, TCM, TCE und M), die mit einem Zelllebensfähigkeitstest analysiert wurden. (B) Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit nach Behandlung mit Kombinationen aus Tumornekrosefaktor-α (TNF-α; T), Cycloheximid (CHX; C), Mycophenolsäure (MPA; M) und Emricasan (E). Kontrollzellen erhielten nur Fahrzeuge. Die Lebensfähigkeit der Zellen jeder Probe wurde gegenüber der Kontrolle ihrer jeweiligen Passage normalisiert. Die TC-Behandlung führte zu einer drastischen Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen. Eine zusätzliche MPA-Behandlung erhöht die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu nur TC deutlich (36,8 vs. 62,9 %). Emricasan konnte den Zelltod in sehr hohem Maße (91 %) verhindern. Die alleinige Behandlung mit MPA zeigte keine Anzeichen einer proliferativen Aktivität des Arzneimittels. **p < 0,01 (C) Western-Blot-Analyse der gespaltenen Caspase-3-Spiegel. Spur 1, Kontrolle. Spur 2, TC. Spur 3, TCM. Die Behandlung mit TC führt zu einem starken Anstieg der gespaltenen Caspase-3-Spiegel. Mit TCM behandelte Zellen zeigen im Vergleich zu mit TC behandelten Zellen eine Verringerung der gespaltenen Caspase-3. Fl, volle Länge. DMSO, Dimethylsulfoxid. MtOH, Methanol. Gapdh, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. Der angezeigte Blot wurde zur besseren Visualisierung beschnitten. Die Kästchen veranschaulichen verschiedene Bereiche desselben Gels. Die nicht zugeschnittenen Blots sind als ergänzende Abbildung 1 zu finden.

Zellen der Behandlungsgruppen Control, TC und TCM wurden wie oben beschrieben behandelt (Abb. 3A). Behandelte Zellen wurden mit eiskaltem PBS von den Schalen abgekratzt und Zellpellets durch 5-minütige Zentrifugation bei 5.000 U/min isoliert, bevor sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurden. Die Zellpellets wurden in RIPA-Puffer mit zusätzlichem Na3VO4 (20 µl/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid (4,4 µl/ml) resuspendiert und dann der BCA-Methode unterzogen, um die Menge an Gesamtprotein zu bestimmen. 15 µg Gesamtprotein wurden pro Spur auf 10 % oder 12 % SDS-Page-Gele geladen. Die getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen, die 1 Stunde lang in 5 % BSA blockiert wurden. Als nächstes wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern sondiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen 1 Stunde lang bei RT mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Die Signale wurden mit SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (#34095, Thermo Scientific) visualisiert und die Banden wurden mit Fiji-ImageJ Version 2.1.0/1.53c42 quantifiziert. Die Proteinexpression wurde als Verhältnis einer spezifischen Bande zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) quantifiziert.

Die folgenden primären Antikörper wurden in dieser Studie verwendet: gespaltener Caspase-3 (Asp175) Antikörper #9661 (Cell Signaling Technology), 1:1.000; GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb#5174 (Cell Signaling Technology), 1:1.000. Als sekundärer Antikörper (1:30.000) wurde ein Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziegenantikörper gegen Kaninchen (Cy™3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L), AB_2307443, Jackson Immuno Research) verwendet.

Zum Vergleich der Quantifizierung des Aktin-Zytoskeletts wurde ein Zwei-Wege-ANOVA-Test verwendet. Zum Vergleich der Ergebnisse des Zelllebensfähigkeitstests wurde ein t-Test mit Welch-Korrektur verwendet. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angegeben.

Um einen umfassenden Überblick über die MPA-induzierten Prozesse zu erhalten, führten wir eine RNA-Sequenzierung (RNAseq) von MPA-behandelten Podozyten durch. Der Versuchsaufbau ist in Abb. 1A dargestellt. Wir identifizierten 351 Gene, die das Kriterium eines angepassten p < 0,05 erfüllten, um im Vergleich zu den Kontrollen als signifikant von der MPA-Behandlung betroffen angesehen zu werden.

Ein Vulkandiagramm visualisiert die Verteilung der Gentranskripte und zeigt, dass von den 351 unterschiedlich exprimierten Genen 130 signifikant reduziert und 221 signifikant erhöht waren (Abb. 1B). Beide Isoformen von IMPDH wurden in allen Proben stark exprimiert, mit einer durchweg höheren Lesezahl für IMPDH II (Suppl. Data). Interessanterweise zeigte IMPDH II eine signifikante kompensatorische Hochregulierung nach MPA-Behandlung (log2FC 0,26, padj = 0,0002).

Um die inhärenten Beziehungen zwischen diesen Genen besser aufzudecken, haben wir unsere Daten nach der Z-Score-transformierten Genexpression jedes Gens organisiert (Abb. 1C). Der Vergleich der Daten zeigt eine beträchtliche Konsistenz der Ausdrucksänderungen innerhalb jeder Bedingung. Es wurden vier Gen-Metacluster identifiziert: herunterreguliert (Cluster 1), stark herunterreguliert (Cluster 2), hochreguliert (Cluster 3) und stark hochreguliert (Cluster 4).

Um molekulare Funktionen und biologische Prozesse zu klären, die von MPA-regulierten Genen beeinflusst werden, und um ihre Relevanz in Podozyten zu untersuchen, führten wir als nächstes eine Anreicherungsanalyse für jeden Cluster mithilfe der Gene Ontology (GO) durch. Abbildung 1C zeigt außerdem eine Auswahl wichtiger Begriffe, die jedem Cluster zugeordnet sind. Als ergänzende Informationen werden vollständige Ergebnistabellen zur Anreicherung bereitgestellt (Supplementary Dataset File 1–4). Anhand der Ergebnisse der Anreicherungsanalyse konnten wir zwei Hauptgruppen von Begriffen skizzieren, die von besonderem Interesse waren.

Bei der Betrachtung der signifikanten Begriffe der Cluster mit durch MPA-Behandlung induzierten Genen (Cluster 3 und Cluster 4) stellten wir eine Anhäufung von Begriffen fest, die sich auf die Zytoskelettstruktur der Zelle beziehen. Einerseits gab es eine Zunahme von Begriffen, die die zellulären Komponenten eingrenzen, die von den unterschiedlich exprimierten Genen betroffen sind, wie Aktin-Zytoskelett (Fold Enrichment [FE] 1,7, p = 0,01), Stressfaser (FE 2,2, p = 0,03), oder Actomyosin (FE 2,0, p = 0,04) (Abb. 1C). Andererseits konnten wir auch eine Zunahme von Begriffen beobachten, die mit den dynamischen Veränderungen dieser zellulären Komponenten verbunden sind, wie z. B. der Aktinfilamentbündelanordnung (FE 2,5, p = 0,01) und der Regulierung der durch Rho-Proteine ​​und kleine GTPase vermittelten Signaltransduktion (FE). 3,2 und 3,0, p = 0,004 bzw. 0,03). Zu den mit den Begriffen dieser Untergruppe annotierten Genen gehören SYNPO2L (log2FC 0,80, padj = 466E-10), ein Aktin-assoziiertes Protein aus der Synaptopodin-Familie, und ITGB1 (log2FC 0,17, padj = 0,0006), ein Protein, das für die Organisation des Zytoskeletts und die Signaltransduktion entscheidend ist in Podozyten. Darüber hinaus konnten wir eine Hochregulierung von Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (z. B. ARHGEF2), nachgeschalteten Effektoren von RhoA (z. B. ROCK2) und anderen Proteinen beobachten, die die Aktivität kleiner GTPasen (z. B. AMOT) beeinflussen (Tabelle 1).

Eine weitere große Gruppe, die uns aufgefallen ist, umfasst Begriffe im Zusammenhang mit Entzündungswegen und Zelltod. Hier konnten wir eine Zunahme von Begriffen feststellen, die die Herunterregulierung von Entzündungswegen beschreiben, insbesondere der p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (p38MAPK) und des Kernfaktor-Kappa-Light-Chain-Enhancer-Wegs aktivierter B-Zellen (NF-κB). Die negative Regulation der p38MAPK-Kaskade (FE 5,3, p = 0,001) stellte sich als GO-Term mit der größten Anreicherung dar (Abb. 1C). Bemerkenswerterweise fanden wir einen Anstieg der Gentranskripte der Familie der dualen Spezifitätsproteinphosphatasen (DUSP), nämlich DUSP1, DUSP4 und DUSP6 (log2FC 0,23, 0,39, 0,31 und padj = 0,0004, 9,33E-05, 0,007). Die Behandlung mit MPA erhöht auch die Transkription der Ubiquitin-Carboxyl-terminalen Hydrolase CYLD (log2FC 0,12, padj = 0,04), von der bekannt ist, dass sie die NF-κB-, p38MAPK- und c-Jun-N-terminale Kinase (JNK)-Kaskaden unterdrückt. Gleichzeitig wurden Begriffe, die die Aktivierung dieser Signalwege durch INF-χ und den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) betreffen, deutlich herunterreguliert und erschienen daher in Cluster 1. Ein Beispiel für ein herunterreguliertes Transkript ist THBS1 (log2FC − 0,16, padj = 0,006). ), was, wenn es übersetzt wird, zu einer Aktivierung der TNF-α- und TGF-β-Signalwege führen kann. Das Transkript mit der größten negativen Faltungsänderung nach MPA-Behandlung ist PLK-1 (log2FC − 1,03, padj = 0,0004), was sich in eine Serin-Threonin-Kinase mit wichtigen Funktionen bei der Zellzyklusregulation übersetzt. Zusätzlich zur Regulierung von Begriffen, die Entzündungswege betreffen, könnten wir auch eine Zunahme von Begriffen beobachten, die die negative Regulierung von Zelltodwegen erwähnen, wie etwa Apoptose und Nekroptose. Erwähnbare Beispiele für Gene, die durch MPA reguliert und mit diesen Funktionen verknüpft sind, sind CCN-I, PEA15A und DDX3X (Tabelle 2).

Um die biologische Bedeutung von Veränderungen in den Genen des Aktin-Zytoskeletts zu validieren, haben wir einen Versuchsaufbau entworfen, der darauf abzielt, Aktinfilamente auf nicht-immunologische Weise und mit Ähnlichkeit zur Pathophysiologie des nephrotischen Syndroms zu schädigen (Abb. 2A). Anschließend haben wir die Zellen mit Phalloidin angefärbt, das hochselektiv mit F-Aktin interagiert, um die Zytoskelettstruktur jeder Zelle sichtbar zu machen (Abb. 2D). Nach 48-stündiger Inkubation mit BSA zeigten die Zellen eine Desorganisation des Aktin-Zytoskeletts und ein vermehrtes Auftreten von Vakuolen. Die Quantifizierung des Zytoskeletts ergab einen erheblichen Rückgang der Zellen mit dicken Kabeln (Typ A und B) nach der Behandlung mit BSA im Vergleich zu den Kontrollen. Gleichzeitig stieg die Anzahl der Zellen mit dünnen oder keinen Kabeln (Typ C und D) im Vergleich zu Kontrollzellen deutlich an (Abb. 2B). Interessanterweise zeigte die BSA + MPA-Gruppe ein völlig anderes Erscheinungsbild als die BSA + Veh-Gruppe. Die Anzahl der Zellen vom Typ A und B stieg im Vergleich zu Zellen, die nur mit BSA behandelt wurden, signifikant an (p = 0,004 bzw. p = 0,001, Abb. 2B). Gleichzeitig nahm der Anteil der Typ-D-Zellen, die keine Stressfasern enthielten, deutlich ab (p = 0,004, Abb. 2C), was eine Annäherung des Aktin-Zytoskelettmusters von BSA + MPA-Zellen an das der Kontrollzellen zeigt. Die Behandlung nur mit MPA führte zu einer ähnlichen Verteilung der Zelltypen wie bei den Kontrollen.

Als nächstes untersuchten wir die Folgen der transkriptomischen Veränderungen hinsichtlich Entzündung und Zelltod in einer funktionellen Umgebung. Angesichts der Signalwege, die durch die MPA-Behandlung beeinflusst zu werden scheinen, haben wir TNF-α und CHX als geeignete, synergistisch wirkende Stressmittel mit einer starken Fähigkeit zur Auslösung des Zelltods ausgewählt. Der Versuchsaufbau ist in Abb. 3A dargestellt. Mithilfe des Neutralrot-Aufnahmetests stellten wir fest, dass die Behandlung mit TNF-α und CHX die Zelllebensfähigkeit auf nur 36,8 % reduzierte (Abb. 3B). Bei gleichzeitiger Behandlung mit MPA war kein signifikanter Unterschied im Zellüberleben erkennbar (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen mit einem Behandlungsplan, der eine 24-stündige Vorbehandlung mit MPA umfasste, eine deutlich verringerte Zelltodrate, wobei 62,9 % der Zellen nach Inkubation mit TNF-α und CHX lebensfähig waren (Abb. 3B, p = 0,008). Emricasan, ein Inhibitor der Pan-Caspasen, konnte die zellschädigende Aktivität der beiden Wirkstoffe stark verringern, so dass 91 % der Zellen nach der Behandlung lebensfähig blieben. Ein proliferativer Effekt aufgrund der MPA-Behandlung wurde anhand einer reinen MPA-Gruppe ausgeschlossen (Abb. 3B). Um unsere Ergebnisse weiter zu validieren und die Rolle der Caspase-Hemmung durch MPA aufzuklären, haben wir beschlossen, eine Western-Blot-Analyse der CC3-Spiegel durchzuführen. Wie erwartet löste die TC-Behandlung die Caspase-3-Spaltung stark aus. Noch wichtiger ist, dass wir herausfanden, dass eine zusätzliche MPA-Behandlung die Menge an CC3 verringerte (Abb. 3C). Eine Quantifizierung der Western-Blot-Ergebnisse finden Sie in den Zusatzinformationen (Supp. Abb. 2).

Unseres Wissens sind wir die ersten, die einen unvoreingenommenen transkriptomischen Ansatz verwenden, um zu untersuchen, wie MPA Podozyten in einer nicht-immunologischen Umgebung günstig beeinflusst. Interessanterweise zeigte das Ergebnis der Transkriptomanalyse, dass die Behandlung mit MPA über 24 Stunden die Gentranskription von IMPDH II signifikant steigerte (Abb. 1B), was auf eine wirksame Exposition gegenüber MPA schließen lässt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Untersuchungen, die ebenfalls gezeigt hatten, dass murinen Podozyten IMPDH-Transkripte exprimieren und dass die IMPDH-Aktivität in Zellkulturen gehemmt werden kann43.

Durch hierarchisches Clustering wurden vier Cluster identifiziert, die dann mithilfe einer GO-Term-Anreicherungsanalyse auf funktionale Auswirkungen analysiert wurden. Bei näherer Betrachtung stellten wir fest, dass es eine Anhäufung angereicherter Begriffe im Zusammenhang mit Aktin gab, insbesondere in Clustern hochregulierter Gene, wie z. B. Aktin-Zytoskelett und Regulierung der durch kleine GTPase vermittelten Signaltransduktion (Abb. 1C). Aktin ist die vorherrschende Zytoskelettstruktur in FPs und wie bereits erwähnt, kann seine Reorganisation oder Dysfunktion eine Hauptursache für Proteinurie sein44,45,46. Da nachgewiesen wurde, dass die Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts eine direkte Wirkung von Cyclosporin A auf Podozyten ist19, haben wir getestet, ob MPA eine ähnliche Fähigkeit besitzt, direkt auf das Aktin-Zytoskelett der Podozyten einzuwirken. Deshalb haben wir einen Versuchsaufbau entworfen, bei dem BSA als Stressmittel verwendet wurde. Im Einklang mit früherer Literatur37 verringerte die BSA-Behandlung die Menge und Dicke der Stressfasern deutlich. Insbesondere war MPA in der Lage, die Zellen vor der durch Albuminüberladung verursachten Schädigung zu schützen. Die Behandlung mit MPA stellte die Anzahl der aktinreichen Typ-A- und B-Zellen wieder her und zeigte gleichzeitig einen signifikanten Rückgang der Typ-D-Zellen im Vergleich zur BSA + Veh-Gruppe (Abb. 2B, C).

Dieses Ergebnis unterstützte nachdrücklich unser Konzept einer stabilisierenden Wirkung von MPA auf das Aktin-Zytoskelett. Als nächstes gingen wir zurück zu unseren Transkriptomdaten und untersuchten die mit der Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts verbundenen Gene genauer. Der erste interessante Kandidat war SYNPO2L (Tabelle 1). SYNPO2L ist ein Mitglied der Synaptopodin-Familie, von dem in zahlreichen Studien gezeigt wurde, dass es das Aktin-Zytoskelett stabilisiert38,47,48,49. Bei Überexpression kann SYNPO2L selbst den Aktin-Signalweg aktivieren, Proteine ​​wie RhoA und Actn2 erhöhen und gleichzeitig die Bildung von Stressfasern induzieren50. Da Synaptopodin beim nephrotischen Syndrom im Kindesalter verloren geht51, könnte ein Anstieg eines Mitglieds der Synaptopodin-Familie, wie SYNPO2L, möglicherweise den Verlust des Aktin-unterstützenden Proteins ausgleichen. Ein weiteres interessantes Gen, das durch MPA reguliert wird, ist ITGB1, ein wichtiges Adhäsionsmolekül in Podozyten, das sowohl unter mechanischem Stress als auch unter Albuminüberladung herunterreguliert wird, beides führende pathologische Mechanismen in INS52,53. Die Abnahme von ITGB1 kann zu einer verminderten Podozytenadhäsion und einem Anstieg der Caspase-3-Aktivität führen54. Lee et al. konnten zeigen, dass Pyrintegrin, ein Beta1-Integrin-Agonist, murinen Podozyten vor Auslöschung und anschließend Mäusen vor Proteinurie schützen kann55. In unserer Studie haben wir herausgefunden, dass MPA die Transkription des ITGB1-Gens erhöht und dabei möglicherweise seine stabilisierende Wirkung auf Podozyten nutzt.

Eine weitere Untersuchung der RNAseq-Daten ergab eine weitere Gruppe von Begriffen, darunter die negative Regulierung von p38MAPK und die negative Regulierung des apoptotischen Prozesses in den hochregulierten Clustern sowie eine negative Regulierung des TGF-β-Rezeptor-Signalwegs, die mit Zelltod und Entzündungen verbunden sind (Abb . 1C). Der p38MAPK-Weg ist ein bekannter proinflammatorischer und proapoptotischer Weg, der unter anderem bei Stress des endoplasmatischen Retikulums (ERS) aktiviert wird56,57. Es wurde gezeigt, dass ERS, TGF-β und p38MAPK in vitro durch Albuminüberladung in Podozyten hochreguliert werden37,58. Koshikawa et al. konnten zeigen, dass die p38MAPK-Aktivierung in Nagetier-Nierenerkrankungsmodellen sowie bei menschlichen Glomerulopathien, einschließlich MCGN und FSGS59, erhöht ist. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen erwies sich die Hemmung von TGF-β und p38MAPK in vitro und in vivo als schützend für Podozyten37,59,60. Unter Berücksichtigung unserer transkriptomischen Analyse zusammen mit den oben genannten Studien haben wir getestet, ob MPA die Fähigkeit besitzt, Podozyten vor Entzündungen und anschließendem Zelltod zu schützen, und haben diese Hypothese mithilfe eines Zelllebensfähigkeitstests überprüft. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass das nephrotische Syndrom bei Mäusen und die Albuminexposition gegenüber Podozyten in vitro die TNF-RNA61 erhöhen, was wiederum eine Schädigung der Podozyten und das Fortschreiten der glomerulären Erkrankung auslösen kann62,63. Deshalb behandelten wir unsere Zellen mit einer routinemäßig verwendeten Kombination aus TNF-α und CHX, was sich massiv negativ auf das Überleben der Podozyten auswirkte. Dennoch konnten wir ein signifikant höheres Überleben der mit MPA vorbehandelten Zellen im Vergleich zu den nicht mit MPA behandelten Zellen nachweisen (62,9 % vs. 36,8 %, Abb. 3B). Somit belegen unsere Daten eindrucksvoll, dass der TNF-α-induzierte Zelltod wirksam gemildert werden kann, wenn Zellen mit MPA vorbehandelt werden. Im Gegensatz dazu war die Behandlung mit MPA nach Stimulation mit TNF-α nicht erfolgreich bei der Verhinderung des Zelltods. Anschließend haben wir gezeigt, dass die MPA-Behandlung die durch die TC-Behandlung induzierte Caspase-3-Spaltung verringert (Abb. 3C). Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass MPA den durch TNF-α verursachten Zelltod in kultivierten Podozyten abschwächt. Mechanistisch kann dies zumindest teilweise mit einer Verringerung der Caspase-3-Aktivierung zusammenhängen.

Bemerkenswerterweise zeigten unsere transkriptomischen Ergebnisse die Hochregulierung von drei Mitgliedern der DUSP-Familie nach MPA-Behandlung, nämlich DUSP1, 4 und 6, die negative Regulatoren der MAPK-Signalwege, einschließlich des p38- und JNK-Signalwegs, sind (Tabelle 2)64. Es wurde festgestellt, dass DUSP4 und 6 in Modellen für diabetische Nephropathie beide verringert waren65,66. Bei Überexpression in der Podozytenkultur verringert DUSP4 die Aktivierung von p38MAPK, JNK und Caspase-365. In ähnlicher Weise schützt die Überexpression von DUSP6 Podozyten vor dem Verlust von Synaptopodin und Nephrin und reduziert gleichzeitig die durch hohe Glukosewerte induzierte Apoptose66.

Weitere erwähnenswerte Gene, die von MPA betroffen sind und möglicherweise eine Rolle bei der Behandlung proteinurischer Erkrankungen spielen könnten, sind PLK-1 und CXCL12, die beide durch MPA-Behandlung herunterreguliert wurden (Tabelle 2). PLK-1 ist ein Schlüsselregulator des Zellzyklus und der Zellteilung und seine Hemmung reduziert nachweislich die Proteinurie in einem diabetischen Nephropathiemodell67,68. CXCL12, auch als aus Stromazellen abgeleiteter Faktor bekannt, ist ein homöostatisches Chemokin, dessen Produktion durch Podozyten nachweislich zum Podozytenverlust und zur Albuminurie bei Typ-2-Diabetes beiträgt69. Seine Blockade lindert die Proteinurie und erhöht die Podozytenzahl in Modellen sowohl der diabetischen Nephropathie als auch der Adriamycin-induzierten Nephropathie70,71.

Zusammengenommen schützt MPA tatsächlich das Aktin-Zytoskelett und kann den Zelltod von Podozyten in Zellkulturen verhindern. Obwohl unsere Ergebnisse hinsichtlich der Zelltypspezifität und der Umgebungsbedingungen die üblichen Einschränkungen kultivierter Podozyten aufweisen, ist das Zellkulturmodell äußerst wertvoll für die Untersuchung von Wirkungen, die über die von Immunzellen auf Podozyten hinausgehen und die Ergebnisse in fast allen In-vivo-Modellen verfälschen. Dennoch müssen zukünftige Studien die Übertragbarkeit unserer Ergebnisse in Tiermodelle untersuchen und unsere Ergebnisse mit der transkriptomischen Analyse menschlicher Proben vergleichen. Das Verständnis der Wirkmechanismen klinisch eingesetzter Immunsuppressiva bei INS wird dazu beitragen, Therapiepläne weiter anzupassen, um das therapeutische Potenzial voll auszuschöpfen. Zusammenfassend liefert diese Studie überzeugende Beweise für eine direkte positive Wirkung von MPA auf Podozyten und liefert gleichzeitig mögliche verantwortliche Wege.

Sequenzierungsdaten sind in der ArrayExpress-Datenbank unter dem folgenden Link verfügbar: https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress/studies/E-MTAB-11702?key=76ebcb9d-12e4-4e3b-b0e2-cada7edc4bf5.

Allison, A. Wirkmechanismen von Mycophenolatmofetil. Lupus 14(3_Suppl), 2–8. https://doi.org/10.1191/0961203305lu2109oa (2005).

Artikel Google Scholar

Allison, AC und Eugui, EM Mycophenolatmofetil und seine Wirkmechanismen. Band 47. (2000). www.elsevier.comrlocaterimmpharm.

Eugui, EM, Mirkovich, A. & Allison, AC Lymphozytenselektive antiproliferative und immunsuppressive Wirkung von Mycophenolsäure bei Mäusen. Scan. J. Immunol. 33(2), 175–183. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1991.tb03747.x (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carr, SF, Papp, E., Wu, JC & Natsumeda, Y. Charakterisierung menschlicher IMP-Dehydrogenasen vom Typ I und Typ II. J. Biol. Chem. 268(36), 27286–27290. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)74247-1 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sollinger, H. Mycophenolatmofetil zur Vorbeugung einer akuten Abstoßung bei Empfängern von primären Nieren-Allotransplantaten von Leichen. Transplantation 60(3), 225–232 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kuhn, A. et al. Die Diagnose und Behandlung von systemischem Lupus erythematodes. Dtsch. Arztebl. Int. 112(25), 423–432. https://doi.org/10.3238/arztebl.2015.0423 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rovin, BH et al. KDIGO 2021-Leitlinie für die klinische Praxis zur Behandlung glomerulärer Erkrankungen. Niere Int. 100(4), S1–S276. https://doi.org/10.1016/j.kint.2021.05.021 (2021).

Artikel Google Scholar

Noone, DG, Iijima, K. & Parekh, R. Idiopathisches nephrotisches Syndrom bei Kindern. The Lancet 392(10141), 61–74. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)30536-1 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Shalhoub, RJ Pathogenese der Lipoidnephrose: Eine Störung der T-Zell-Funktion. Lancet 304(7880), 556–560. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(74)91880-7 (1974).

Artikel Google Scholar

Ravani, P. et al. Rituximab bei Kindern mit steroidabhängigem nephrotischem Syndrom: Eine multizentrische, offene, randomisierte, kontrollierte Nichtunterlegenheitsstudie. Marmelade. Soc. Nephrol. 26(9), 2259–2266. https://doi.org/10.1681/ASN.2014080799 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iijima, K. et al. Rituximab bei im Kindesalter auftretendem, kompliziertem, häufig rezidivierendem nephrotischem Syndrom oder steroidabhängigem nephrotischem Syndrom: Eine multizentrische, doppelblinde, randomisierte, placebokontrollierte Studie. Lancet 384(9950), 1273–1281. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(14)60541-9 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ahn, YH et al. Wirksamkeit und Sicherheit von Rituximab beim schwer zu behandelnden nephrotischen Syndrom, das im Kindesalter auftritt. Medizin 97, 1–9 (2018).

Artikel Google Scholar

Tryggvason, K. & Wartiovaara, J. Molekulare Grundlagen der glomerulären Permselektivität. Curr. Meinung. Nephrol. Hypertoniker. 10(4), 543–549. https://doi.org/10.1097/00041552-200107000-00009 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Garg, P. Ein Überblick über die Biologie der Podozyten. Bin. J. Nephrol. 47 (Beilage 1), 3–13. https://doi.org/10.1159/000481633 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Benzing, T. Signalisierung an der Schlitzblende. Marmelade. Soc. Nephrol. 15(6), 1382–1391. https://doi.org/10.1097/01.ASN.0000130167.30769.55 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Butt, L. et al. Ein molekularer Mechanismus, der Albuminurie bei Nierenerkrankungen erklärt. Nat. Metab. 2(5), 461–474. https://doi.org/10.1038/s42255-020-0204-y (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fornoni, A., Sageshima, J., & Wei, C., et al. Rituximab zielt auf Podozyten bei rezidivierender fokaler segmentaler Glomerulosklerose ab. (2011). www.ScienceTranslationalMedicine.org.

Hosseiniyan Khatibi, SM, Ardalan, M., Abediazar, S. & Zununi Vahed, S. Der Einfluss von Steroiden auf die verletzten Podozyten beim nephrotischen Syndrom. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2019.105490 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Faul, C. et al. Das Aktin-Zytoskelett von Nierenpodozyten ist ein direktes Ziel der antiproteinurischen Wirkung von Cyclosporin A. Nat Med. 14(9), 931–938. https://doi.org/10.1038/nm.1857 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ziswiler, R., Steinmann-Niggli, K., Kappeler, A., Daniel, C. & Marti, HP Mycophenolsäure: Ein neuer Ansatz zur Therapie der experimentellen mesangialen proliferativen Glomerulonephritis. Marmelade. Soc. Nephrol. 9(11), 2055–2066. https://doi.org/10.1681/asn.v9112055 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hauser, IA, Renders, L., Radeke, HH, Sterzel, RB & Goppelt-Struebe, M. Mycophenolatmofetil hemmt die Proliferation von Mesangialzellen bei Ratten und Menschen durch Guanosinmangel. Nephrol. Wählen. Transplantation. 14(1), 58–63. https://doi.org/10.1093/ndt/14.1.58 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lv, W., et al. Mycophenolatmofetil hemmt die Hypertrophie und Apoptose von Podozyten in vivo und in vitro. Band 8. www.ijcem.com/. (2015).

Nakhoul, F. et al. Glomeruläre Häufigkeit von Nephrin und Podocin beim experimentellen nephrotischen Syndrom: Verschiedene Wirkungen antiproteinurischer Therapien. Bin. J. Physiol. Ren. Physiol. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00451.2004 (2005).

Artikel Google Scholar

Fu, J. et al. Die transkriptomische Analyse deckt neue synergistische Mechanismen in der Kombinationstherapie bei Lupusnephritis auf. Niere Int. 93(2), 416–429. https://doi.org/10.1016/j.kint.2017.08.031 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shankland, SJ, Pippin, JW, Reiser, J. & Mundel, P. Podozyten in Kultur: Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft. Niere Int. 72(1), 26–36. https://doi.org/10.1038/sj.ki.5002291 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Benz, MR et al. Erstellung und Validierung einer begrenzten Probenahmestrategie zur Überwachung der Mycophenolsäureexposition bei Kindern mit nephrotischem Syndrom. Dort. Drogenüberwachung. 41(6), 696–702. https://doi.org/10.1097/FTD.0000000000000671 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Peifer, M. et al. Telomerase-Aktivierung durch genomische Umlagerungen bei Hochrisiko-Neuroblastomen. Natur 526(7575), 700–704. https://doi.org/10.1038/nature14980 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

George, J. et al. Umfassende genomische Profile von kleinzelligem Lungenkrebs. Natur 524(7563), 47–53. https://doi.org/10.1038/nature14664 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: Ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30(15), 2114–2120. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR: Ultraschneller universeller RNA-seq-Aligner. Bioinformatik 29(1), 15–21. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts635 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Anders, S. & Huber, W. Differenzielle Expression und sequenzspezifische Interaktion von Karyopherin α mit Kernlokalisierungssequenzen. J. Biol. Chem. 272(7), 4310–4315. https://doi.org/10.1074/jbc.272.7.4310 (1997).

Artikel Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15(12), 1–21. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0550-8 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Ritchie, ME et al. Limma ermöglicht differenzielle Expressionsanalysen für RNA-Sequenzierung und Microarray-Studien. Nukleinsäuren Res. 43(7), e47. https://doi.org/10.1093/nar/gkv007 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alexa, A. & Rahnenführer, J. topGO: Anreicherungsanalyse für die Genontologie. R-Paketversion 2460. http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html. (2021).

Alexa, A., Rahnenführer, J. & Lengauer, T. Verbesserte Bewertung funktioneller Gruppen aus Genexpressionsdaten durch Dekorrelation der GO-Graphstruktur. Bioinformatik 22(13), 1600–1607. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl140 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kolde, R. Pheatmap: Hübsche Heatmaps. R-Paketversion. ;61(926). https://cran.r-project.org/package=heatmap (2019).

Yoshida, S., Nagase, M., Shibata, S. & Fujita, T. Podozytenschädigung durch Albuminüberladung in vivo und in vitro: Beteiligung von TGF-beta und p38 MAPK. Nephron Exp. Nephrol. https://doi.org/10.1159/000124236 (2008).

Artikel PubMed Google Scholar

Ning, L., Suleiman, HY & Miner, JH Synaptopodin ist für die normale Homöostase der Podozyten entbehrlich, bietet jedoch Schutz im Zusammenhang mit einer akuten Schädigung der Podozyten. Marmelade. Soc. Nephrol. https://doi.org/10.1681/asn.2020050572 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nolop, KB & Ryan, USA Verstärkung der durch Tumornekrosefaktor induzierten Endothelzellschädigung durch Cycloheximid. Bin. J. Physiol. Lungenzellmol. Physiol. https://doi.org/10.1152/ajplung.1990.259.2.l123 (1990).

Artikel Google Scholar

Kieckhöfer, E. et al. Primäre Zilien unterdrücken die Ripk3-vermittelte Nekroptose. Zelltod-Entdeckung. 8(1), 1–12. https://doi.org/10.1038/s41420-022-01272-2 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Hoglen, NC et al. Tetrafluorphenoxy)-pentansäure: Ein auf die Leber gerichteter Caspase-Inhibitor. J. Zelle. Mol. Med. 309(2), 634–640 (2004).

CAS Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: Eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9(7), 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakajo, A. et al. Mizoribin korrigiert eine fehlerhafte Nephrin-Biogenese, indem es das intrazelluläre Energiegleichgewicht wiederherstellt. Marmelade. Soc. Nephrol. 18(9), 2554–2564. https://doi.org/10.1681/ASN.2006070732 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Drenckhahn, D. & Franke, RP Ultrastrukturelle Organisation kontraktiler und zytoskelettaler Proteine ​​in glomerulären Podozyten von Huhn, Ratte und Mensch. Lab Invest. 59(5), 673–682 (1988).

CAS PubMed Google Scholar

Greka, A. & Mundel, P. Zellbiologie und Pathologie von Podozyten. Annu. Pfr. Fr. Physiol. 74, 299–323. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-020911-153238 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Perico, L., Conti, S., Benigni, A. & Remuzzi, G. Podozyten-Aktin-Dynamik in Gesundheit und Krankheit. Nat. Rev. Nephrol. 12(11), 692–710. https://doi.org/10.1038/nrneph.2016.127 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yu, SMW, Nissaisorakarn, P., Husain, I. & Jim, B. Proteinurische Nierenerkrankungen: Schlitzdiaphragma und Zytoskelettansatz eines Podozyten. Vorderseite. Med. https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00221 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Asanuma, K. et al. Synaptopodin orchestriert die Aktinorganisation und Zellmotilität durch Regulierung der RhoA-Signalübertragung. Nat. Zellbiol. 8(5), 485–491. https://doi.org/10.1038/ncb1400 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chalovich, JM & Schroeter, MM Synaptopodin-Familie nativ entfalteter Aktin-bindender Proteine: Physikalische Eigenschaften und mögliche biologische Funktionen. Biophys. Rev. 2(4), 181–189. https://doi.org/10.1007/s12551-010-0040-5 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Eldik, W. et al. Das Z-Disc-Protein CHAPb induziert Kardiomyopathie und kontraktile Dysfunktion im postnatalen Herzen. PLoS ONE 12(12), 1–22. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189139 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Srivastava, T., Garola, RE, Whiting, JM & Alon, US Synaptopodin-Expression beim idiopathischen nephrotischen Syndrom der Kindheit. Niere Int. 59(1), 118–125. https://doi.org/10.1046/j.1523-1755.2001.00472.x (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, D., Lu, Z., Jia, J., Zheng, Z. & Lin, S. Veränderungen in microRNAs im Zusammenhang mit podozytischen Adhäsionsschäden unter mechanischer Belastung. JRAAS J. Renin-Angiotensin-Aldosteron-Syst. 14(2), 97–102. https://doi.org/10.1177/1470320312460071 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheng, YC, Chen, CA, Chang, JM & Chen, HC Albuminüberladung reguliert Integrin-β1 über den Stressweg zwischen reaktiven Sauerstoffspezies und dem endoplasmatischen Retikulum in Podozyten herunter. J. Biochem. 158(2), 101–108. https://doi.org/10.1093/jb/mvv020 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Dessapt, C. et al. Mechanische Kräfte und TGFβ1 reduzieren die Podozytenadhäsion durch Herunterregulierung des α3β1-Integrins. Nephrol. Wählen. Transpl. 24(9), 2645–2655. https://doi.org/10.1093/ndt/gfp204 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Lee, HW et al. Ein Podozyten-basierter automatisierter Screening-Assay identifiziert schützende kleine Moleküle. Marmelade. Soc. Nephrol. 26(11), 2741–2752. https://doi.org/10.1681/ASN.2014090859 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zarubin, T., Han, J. Aktivierung und Signalisierung des P38-MAP-Kinase-Signalwegs. Band 15. www.cell-research.com7C (2005).

Xu, C. et al. Stress des endoplasmatischen Retikulums: Entscheidungen über Leben und Tod von Zellen. Finden Sie die neueste Version: Rezensionsreihe Stress des endoplasmatischen Retikulums: Entscheidungen über Leben und Tod von Zellen. J. Clin. Investieren. 115(10), 2656–2664. https://doi.org/10.1172/JCI26373.2656 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gonçalves, GL, Costa-Pessoa, JM, Thieme, K., Lins, BB & Oliveira-Souza, M. Eine intrazelluläre Albuminüberladung löst Stress im endoplasmatischen Retikulum und eine Aktivierung des PKC-delta/p38 MAPK-Signalwegs aus, um die Apoptose der Podozyten zu induzieren. Wissenschaft. Rep. https://doi.org/10.1038/s41598-018-36933-9 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Koshikawa, M. et al. Rolle der Aktivierung der p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinase bei Podozytenverletzung und Proteinurie beim experimentellen nephrotischen Syndrom. Marmelade. Soc. Nephrol. 16(9), 2690–2701. https://doi.org/10.1681/ASN.2004121084 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pengal, R. et al. Die Hemmung der Proteinkinase MK-2 schützt Podozyten vor Schäden, die durch das nephrotische Syndrom verursacht werden. Bin. J. Physiol. Ren. Physiol. 301, 509–519. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00661.2010.-While (2011).

Artikel Google Scholar

Okamura, K. et al. Die Endozytose von Albumin durch Podozyten löst eine Entzündungsreaktion aus und induziert den apoptotischen Zelltod. PLoS One https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054817 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedigo, CE et al. Lokales TNF verursacht eine NFATc1-abhängige cholesterinvermittelte Podozytenschädigung. J. Clin. Investieren. 126(9), 3336–3350. https://doi.org/10.1172/JCI85939 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, A. et al. Lösliches RARRES1 induziert die Apoptose der Podozyten, um das Fortschreiten der glomerulären Erkrankung zu fördern. J. Clin. Investieren. 130(10), 5523–5535. https://doi.org/10.1172/JCI140155 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, CY & Tan, TH DUSPs, zu MAP-Kinasen und darüber hinaus. Zellbiowissenschaften. https://doi.org/10.1186/2045-3701-2-24 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Denhez, B. et al. Eine durch Diabetes verursachte DUSP4-Reduktion fördert die Dysfunktion der Podozyten und das Fortschreiten der diabetischen Nephropathie. Diabetes 68(5), 1026–1039. https://doi.org/10.2337/db18-0837 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, L. et al. DUSP6 schützt murinen Podozyten vor Entzündungen und Apoptose, die durch einen hohen Glukosespiegel verursacht werden. Mol. Med. Rep. 22(3), 2273–2282. https://doi.org/10.3892/mmr.2020.11317 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barr, FA, Silljé, HHW & Nigg, EA Polo-ähnliche Kinasen und die Orchestrierung der Zellteilung. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 5(6), 429–440. https://doi.org/10.1038/nrm1401 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, L. et al. Die Konnektivitätskartierung identifiziert BI-2536 als potenzielles Medikament zur Behandlung diabetischer Nierenerkrankungen. Diabetes 70(2), 589–602. https://doi.org/10.2337/db20-0580 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sayyed, SG et al. Podozyten produzieren das homöostatische Chemokin Stroma Cell-derived Factor-1/CXCL12, das in einem Mausmodell für Typ-2-Diabetes zu Glomerulosklerose, Podozytenverlust und Albuminurie beiträgt. Diabetologia 52(11), 2445–2454. https://doi.org/10.1007/s00125-009-1493-6 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Darisipudi, MN et al. Die doppelte Blockade des homöostatischen Chemokins CXCL12 und des proinflammatorischen Chemokins CCL2 hat zusätzliche Schutzwirkungen bei diabetischer Nierenerkrankung. Bin. J. Pathol. 179(1), 116–124. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2011.03.004 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Romoli, S. et al. Die CXCL12-Blockade regeneriert vorzugsweise verlorene Podozyten in kortikalen Nephronen, indem sie auf einen intrinsischen Podozyten-Vorläufer-Rückkopplungsmechanismus abzielt. Niere Int. 94(6), 1111–1126. https://doi.org/10.1016/j.kint.2018.08.013 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. AH ist Stipendiat der GPN (Deutsche Gesellschaft für Pädiatrische Nephrologie) und Stipendiat der Peter Stiftung. AH und S.AZ. wurden durch das Cologne Fortune-Stipendium gefördert. Wir danken der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, 491454339) für die Unterstützung der Artikelbearbeitungsgebühr.

Folgende Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Seif El Din Abo Zed und Agnes Hackl.

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Köln, Abteilung für Pädiatrie, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Seif El Din Abo Zed, Agnes Hackl, Gregor Fink, Kai-Dietrich Nüsken, Eva Nüsken & Lutz T. Weber

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Köln, Abteilung II für Innere Medizin und Zentrum für Molekulare Medizin Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Seif El Din Abo Zed, Agnes Hackl, Katrin Bohl, Lena Ebert, Emilia Kieckhöfer, Roman-Ulrich Müller & Bernhard Schermer

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Köln, Pharmakologie im Laborzentrum, Abteilung Therapeutisches Arzneimittelmonitoring DE, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Carsten Müller

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Köln, Cologne Center for Genomics (CCG), Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Kerstin Becker

Kölner Exzellenzcluster für zelluläre Stressreaktionen bei altersbedingten Erkrankungen (CECAD), Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Katrin Bohl, Lena Ebert, Emilia Kieckhöfer, Roman-Ulrich Müller & Bernhard Schermer

Medizinische Fakultät und Universitätsklinikum Köln, Zentrum für Seltene Nierenerkrankungen Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Roman-Ulrich Müller

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AH, K.-DN, EN, CM, BS und LTW haben die Methodik der vorliegenden Arbeit konzipiert und entwickelt. S.AZ., AH, LE, EK und GF untersuchten die vorliegende Angelegenheit und führten die Experimente und die Datenerfassung durch. KB und KB haben die Daten offiziell analysiert. S.AZ. und AH hat den Artikel geschrieben. AHK-DN, ENR-UM und LTW haben den Artikel überprüft und bearbeitet. LTW, BS, K.-DN und R.-UM verwalteten das Projekt und sorgten für Aufsicht und Aufsicht. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Agnes Hackl.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Abo Zed, SED, Hackl, A., Bohl, K. et al. Mycophenolsäure schützt Podozyten direkt, indem sie das Aktin-Zytoskelett erhält und das Zellüberleben erhöht. Sci Rep 13, 4281 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31326-z

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Eingegangen: 21. Oktober 2022

Angenommen: 09. März 2023

Veröffentlicht: 15. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31326-z

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