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May 20, 2023

Kräuterstoffe von TCM-Präparaten entschlüsseln mit dem Multi

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 5988 (2022) Diesen Artikel zitieren 2523 Zugriffe 7 Zitate 2 Altmetric Metrics Details Mit der rasanten Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 5988 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mit der rasanten Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie haben sich auch Ansätze zur Bewertung biologischer Inhaltsstoffe in Präparaten der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) weiterentwickelt. Mithilfe eines Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes könnten theoretisch alle biologischen Inhaltsstoffe aus TCM-Präparaten identifiziert werden, sofern ihre DNA vorhanden ist. Die biologischen Inhaltsstoffe mehrerer klassischer TCM-Präparate wurden auf Basis dieses Ansatzes in früheren Studien erfolgreich analysiert. Die Universalität, Sensitivität und Zuverlässigkeit dieses Ansatzes bei einer Vielzahl von TCM-Präparaten bleibt jedoch unklar. In dieser Studie haben wir vier repräsentative TCM-Präparate, nämlich Bazhen Yimu Wan, Da Huoluo Wan, Niuhuang Jiangya Wan und You Gui Wan, zur konkreten Bewertung des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes ausgewählt. Basierend auf ITS2- und trnL-Biomarkern haben wir die verschriebenen pflanzlichen Materialien (PHMs) in diesen repräsentativen TCM-Präparaten erfolgreich nachgewiesen (minimale Sensitivität: 77,8 %, maximale Sensitivität: 100 %). Die auf ITS2 basierenden Ergebnisse haben auch auf Artenebene eine höhere Zuverlässigkeit als trnL gezeigt, während ihre Kombination eine höhere Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit bieten könnte. Der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz hat eine gute Universalität, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit bei der Dekodierung dieser vier repräsentativen TCM-Präparate gezeigt. In der Omics-Big-Data-Ära hat diese Arbeit zweifellos einen Schritt vorwärts bei der Anwendung des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes in der PHM-Analyse der TCM-Zubereitung hin zu einer besseren Digitalisierung und Modernisierung der Arzneimittelqualitätskontrolle gemacht.

Präparate der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) werden in Kliniken in China seit mindestens 3000 Jahren eingesetzt1,2. In China wird es zur Vorbeugung und Heilung verschiedener Krankheiten eingesetzt und ist in den letzten Jahrzehnten weltweit immer beliebter geworden. TCM-Präparate bestehen aus zahlreichen pflanzlichen, tierischen und/oder mineralischen Stoffen. Gemäß den Richtlinien der chinesischen Medizintheorie und des Chinesischen Arzneibuchs (ChP)3 wurden verschiedene medizinische Materialien zu Pulver zerkleinert oder gekocht, dann gemischt und zusammen mit Honig oder Wasser zu Pillen geformt, um ein TCM-Präparat (auch patentiertes Arzneimittel genannt) zu erhalten. Obwohl TCM-Präparate in den letzten Jahren in großem Umfang eingesetzt wurden, müssen noch viele Probleme gelöst werden, wie etwa die Qualitätskontrolle (QC), bei der besonderes Augenmerk auf die Materialien und den Produktionsprozess gelegt werden sollte, um ihre Sicherheit und Wirksamkeit zu gewährleisten. Die TCM-Qualitätsbewertung umfasst hauptsächlich die qualitative und quantitative Analyse chemischer Inhaltsstoffe und biologischer Inhaltsstoffe4. Aktuelle Methoden zur Qualitätskontrolle von TCM-Präparaten werden hauptsächlich auf der Grundlage chemischer Profilierung4 bewertet (z. B. Dünnschichtchromatographie (TLC)5, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Ultraviolett (HPLC–UV)6, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC–MS). )7). Im Vergleich zu Referenz-Kräutermaterialien oder Zielverbindungen können TLC- und HPLC-Methoden Arteninformationen abrufen, sind jedoch nicht präzise genug, insbesondere für die Identifizierung hybrider genetischer Arten, die zu einer falschen Identifizierung führen und zu biologischer Verschmutzung und Verfälschung der Pflanzenmaterialien führen können Sammlungs- und Herstellungsprozess. Allerdings könnte die Verwendung von DNA, einem Fragment, das in allen Geweben stabil vorkommt8, pflanzliche Materialien auf Artenebene genau identifizieren, was ein höheres Maß an Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit bietet und somit den Nachteil der chemischen Analyse kompensiert9,10.

Das Konzept der Analyse biologischer Inhaltsstoffe auf Basis von DNA-Barcodes wurde von Hebert11 vorgeschlagen. Chen et al. haben zunächst mehrere mögliche DNA-Barcodes verwendet, um Heilpflanzen und ihre eng verwandten Arten zu identifizieren12. Coghlan et al. haben zum ersten Mal DNA-Barcodes verwendet, um festzustellen, ob TCM-Präparate Derivate gefährdeter, handelsbeschränkter Pflanzen- und Tierarten enthalten2. Im Jahr 2014 stellten Cheng et al. haben erstmals über die Analyse biologischer Inhaltsstoffe für Liuwei Dihuang Wan (LDW) unter Verwendung der metagenomischen Methode basierend auf ITS2- und trnL-Biomarkern berichtet13. Danach erschienen Berichte über die Kräuter von TCM-Präparaten, die auf DNA-Biomarkern basieren, wie etwa Yimu Wan (YMW)14, Longdan Xiegan Wan (LXW)15 und Jiuwei Qianghuo Wan (JQW)16. Interessanterweise haben aktuelle Studien über mehrere TCM-Präparate berichtet, die bei der Vorbeugung und Behandlung von COVID-19 wirksam sein könnten17,18, wie z. B. die Lianhua Qingwen-Kapsel19, das Jinhua Qinggan-Granulat19, das Yiqi Qingjie-Kräuterpräparat20 usw. Unterstützt durch die DNA-Barcode-Technologie Es wurde berichtet, dass die Lianhua Qingwen-Kapsel bei der Vorbeugung oder Behandlung von COVID-19 wirksam sein könnte, was möglicherweise auf ihre biologischen Inhaltsstoffe wie Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma und Rhei Radix Et Rhizome3 zurückzuführen ist. Das gleiche Prinzip gilt für Jinhua Qinggan-Granulat und Yiqi Qingjie-Kräutermischungen. Diese Ergebnisse unterstreichen erneut die Bedeutung der Analyse biologischer Inhaltsstoffe von TCM-Präparaten mithilfe des DNA-Barcode-Ansatzes.

Ein TCM-Präparat kann als „synthetisiertes Artengemisch“ betrachtet werden, das dem analytischen Ziel des metagenomischen Ansatzes ähnelt. Basierend auf geeigneten DNA-Biomarkern könnte die genetische Information aller DNA-haltigen Inhaltsstoffe am effektivsten und kostengünstigsten durch Hochdurchsatzsequenzierung gewonnen werden. Aufgrund der Konservierung von ITS221 und seiner hohen interspezifischen und intraspezifischen Divergenzkraft22,23,24 sowie der Bequemlichkeit der Amplifikation von DNA aus stark degradierten Proben basierend auf einem kurzen Fragment trnL25,26,27 sind diese beiden Fragmente werden üblicherweise als Biomarker für die Identifizierung pflanzlicher Arten verwendet. Ein solcher Ansatz, der auf mehreren Barcodes für die Analyse pflanzlicher Inhaltsstoffe basiert, wird als „Multi-Barcoding-Ansatz“ oder „Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz“ bezeichnet.

Trotz der wissenschaftlichen Fortschritte neuerer Studien bleibt die Solidität (dh Universalität, Sensitivität und Zuverlässigkeit) des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes zur Identifizierung verschiedener biologischer Inhaltsstoffe von TCM-Präparaten unklar. Daher haben wir vier repräsentative TCM-Präparate ausgewählt, darunter drei weit verbreitete TCM-Präparate Niuhuang Jiangya Wan (NJW), Bazhen Yimu Wan (BYW) und Yougui Wan (YGW) mit einfachen Zusammensetzungen sowie Da Huoluo Wan (DHW) mit vielen kompliziertere Komponenten als Ziele für die Bewertung pflanzlicher Materialien mithilfe der Biomarker ITS2 und trnL. Basierend auf der Bewertung der vorgeschriebenen Kräuterarten (PHS) der vorgeschriebenen Kräutermaterialien (PHMs) wurden die Universalität, Sensitivität und Zuverlässigkeit des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes bewertet, was seine Leistungsfähigkeit bei der PHMs-Bewertung für TCM-Präparate bestätigte.

Obwohl die pflanzlichen Inhaltsstoffe mehrerer weit verbreiteter TCM-Präparate, darunter LDW13, YMW14, LXW15 und JQW16, kürzlich bewertet wurden, ist es wichtig, repräsentative Präparate auszuwählen, um ein tieferes Verständnis der Leistung des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes zu erhalten. Daher haben wir alle Inhaltsstoffe (einschließlich Kräuter, Tiere und Mineralien) und pflanzliche Materialien nur für die in ChP (Version 2015) erfassten TCM-Präparate untersucht (Abb. 1A,B)3. Die meisten TCM-Präparate enthalten weniger als 25 Inhaltsstoffe bzw. 20 pflanzliche Stoffe. Daher haben wir für die Bewertung des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes TCM-Präparate mit umfassender Anwendung von einfachen bis hin zu komplexen Zusammensetzungen ausgewählt. Unter ihnen haben BYW, NJW und YGW einfache Zusammensetzungen und DHW hat viel komplexere Inhaltsstoffe (Abb. 1C und Ergänzungstabelle S1).

Der Vertrieb aller Inhaltsstoffe und ausschließlich der pflanzlichen Materialien aller im chinesischen Arzneibuch aufgeführten TCM-Präparate. (A) Alle Inhaltsstoffe des TCM-Präparats, einschließlich pflanzlicher, tierischer und mineralischer Stoffe. (B) Die pflanzlichen Stoffe, die in einem TCM-Präparat enthalten sind. Die x-Achse stellt die Anzahl der enthaltenen rein pflanzlichen Inhaltsstoffe eines TCM-Präparats dar, die y-Achse bedeutet die entsprechende Anzahl der TCM-Präparate. Die Abkürzungen werden angezeigt, von links nach rechts: Yatong Yili Wan (YYW), Yimu Wan (YMW), Liuwei Dihuang Wan (LDW), Bazhen Yimu Wan (BYW), Yougui Wan (YGW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW), Jiuwei Qianghuo Wan (JQW), Longdan Xiegan Wan (LXW) bzw. Da Huoluo Wan (DHW). (C) Die Verteilung aller Inhaltsstoffe und die detaillierten Inhaltsstoffe von neun TCM-Präparaten. Die Abkürzungen sind von links nach rechts dargestellt: Bazhen Yimu Wan (BYW), Da Huoluo Wan (DHW), Jiuwei Qianghuo Wan (JQW), Liuwei Dihuang Wan (LDW), Longdan Xiegan Wan (LXW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW). ), Yougui Wan (YGW), Yimu Wan (YMW) bzw. Yatong Yili Wan (YYW). Die schwarz markierten Wörter sind diejenigen, über die bereits in früheren Studien berichtet wurde, während die rot markierten Wörter die in dieser Arbeit verwendeten Forschungsvorbereitungen darstellen.

Für diese vier repräsentativen TCM-Präparate haben wir nach vorläufiger Qualitätskontrolle (QC) (weitere Einzelheiten im Abschnitt „Methoden“) 25.271.042 ITS2- und 27.599.145 trnL-Sequenzierungsablesungen erhalten. In jeder Probe wurden durchschnittlich 48.493 ITS2-Sequenzierungsablesungen für BYW, 87.911 für DHW, 161.025 für NJW und 58.501 für YGW nachgewiesen. Im Durchschnitt wurden 57.954 trnL-Messwerte für BYW, 139.521 für DHW, 129.560 für NJW und 61.685 für YGW erkannt (Tabelle 1). Die Länge (maximale, durchschnittliche und minimale Länge) jeder aus diesen TCM-Präparationsproben erhaltenen Sequenz ist in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Anschließend wurde für jede Probe eine Verdünnungsanalyse durchgeführt, um die Sequenzierungstiefe zu ermitteln. Alle Verdünnungskurven erreichten eine Sättigung bei etwa 10.000 Sequenzen pro Probe (ergänzende Abbildung S1), was darauf hindeutet, dass die Sequenzierungstiefe ausreichte, um alle Arteninformationen in allen Proben für die vier TCM-Präparate zu erfassen. Da die trnL-Datenbank im Vergleich zu ITS2 kleiner war, haben wir die durch den ITS2-Barcode erkannten Arten mit einer relativen Häufigkeit unter 0,002 bzw. die durch den trnL-Barcode erkannten Arten mit einer relativen Häufigkeit unter 0,001 gefiltert. Danach wurde basierend auf ITS2 eine durchschnittliche Sequenz von 47.533 für BYW-Proben, 86.642 für DHW-Proben, 160.712 für NJW-Proben und 58.008 für YGW-Proben sowie 56.367 (BYW), 130.330 (DHW), 129.012 (NJW) und 59.709 ( YGW) wurden jeweils basierend auf trnL erhalten (Tabelle 1).

Im Allgemeinen haben mehrere pflanzliche Materialien mehr als ein PHS. Beispielsweise gibt es drei Arten von Süßholz: Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza inflate und Glycyrrhiza glabra. Folglich sollte jede ursprüngliche PHM-Art als PHS betrachtet werden. Beispielsweise enthält BYW acht PHMs, NJW und YGW neun PHMs und DHW enthält 36 PHMs, während sie jeweils 11, 15, 10 und 57 PHS umfassen (Tabelle 2 und Ergänzungstabelle S3).

Die Ergebnisse des ITS2-Audits an 18 BYW-Proben zeigten, dass im Durchschnitt 8,2 PHS, 1,0 substituierte Kräuterarten (SHS) und 13,8 kontaminierte Kräuterarten (CHS) nachgewiesen wurden, während 5,0 PHS, 0,3 SHS und 14,9 CHS darin gefunden wurden jede trnL-Probe (Abb. 2A, B). Für Warmwasser hat jede Probe einen Durchschnitt von 23,7 PHS, 5,1 SHS und 21,1 CHS basierend auf ITS2, während ein Durchschnitt von 17,9 PHS, 6,8 SHS und 27,7 CHS basierend auf trnL vorliegt (Abb. 2C, D). Bei NJW-Proben wurden basierend auf ITS2 durchschnittlich 7,2 PHS, 2,8 SHS und 1,8 CHS in jeder Probe nachgewiesen, was mehr als trnL war (3,0 PHS, 3,0 SHS und 24,0 CHS; Abb. 2E,F). Die in jeder YGW-Probe nachgewiesenen Mittelwerte von PHS, SHS und CHS betrugen 4,8, 0,9 und 10,4 basierend auf ITS2 und 3,7, 0,5 bzw. 17,3 basierend auf trnL (Abb. 2G, H). Diese Unterschiede können teilweise auf die Vollständigkeit der ITS2- und trnL-Datenbank sowie auf ihre intrinsischen Auflösungseigenschaften zurückzuführen sein.

Die Verteilung der erkannten Arten in vier repräsentativen TCM-Präparaten, die von zwei Herstellern gekauft wurden, basierend auf ITS2 und trnL. (A) BYW-Proben basierend auf ITS2; (B) BYW-Proben basierend auf trnL; (C) Warmwasserproben basierend auf ITS2; (D) Warmwasserproben basierend auf trnL; (E) NJW-Proben basierend auf ITS2; (F) NJW-Proben basierend auf trnL. (G) YGW-Proben basierend auf ITS2; (H) YGW-Proben basierend auf trnL. Vom PHS verschriebene Kräuterarten, vom SHS substituierte Kräuterarten, vom CHS kontaminierte Kräuterarten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz die pflanzlichen Materialien, einschließlich verschriebener, ersetzter und kontaminierter Materialien, für repräsentative TCM-Präparate (einschließlich BYW, DHW, NJW und YGW) erkennen könnte. Das Ergebnis hat gezeigt, dass der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz eine gute Universalität beim Nachweis von PHMs aus TCM-Präparationsproben aufweist.

Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Zusammensetzung von TCM-Präparaten zu ermitteln. Wir wählten ein TCM-Präparat (NJW) mit relativ einfacher Zusammensetzung und umfassender Anwendung und ein anderes TCM-Präparat (DHW) mit komplexeren Inhaltsstoffen als Ziele für die Entschlüsselung ihrer PHMs durch Identifizierung ihrer PHS aller TCM-Präparate basierend auf ITS2- bzw. trnL-Datensätzen.

Das Ergebnis der ITS2-Prüfung an NJW-Proben ergab, dass alle PHMs (9 pflanzliche Materialien), einschließlich der verarbeiteten pflanzlichen Materialien (wie Scutellaria-Extrakt), erfolgreich nachgewiesen werden konnten, was 12 erkannte PHS abdeckt (Tabelle 3, Abb. 3A und ergänzende Abb . S2C). Senna obtusifolia (die durchschnittliche relative Häufigkeit betrug 48,4 %) und Senna tora (45,4 %) waren die dominierenden Arten in allen Proben, gefolgt von Paeonia lactiflora (3,4 %) und Ligusticum chuanxiong (1,0 %). Die Ergebnisse legten nahe, dass die modifizierte CTAB-Methode zur Extraktion ihrer DNA geeignet war und die Primer besser zur Amplifikation ihrer Sequenzen geeignet waren. Neben dem PHS wurden auch sieben SHS gefunden, die zu Codonopsis, Ligusticum, Mentha, Paeonia und Senna gehören (ihre durchschnittliche relative Häufigkeit betrug 0,035 %), sowie sechs möglicherweise kontaminierte Gattungen, nämlich Ipomoea, Amaranthus, Anemone, Cuscuta, Pogostemon und Zanthoxylum könnten während des biologischen Experiments oder Herstellungsprozesses eingeführt werden.

Die Verteilung der vorgeschriebenen Kräuterarten (PHS), die in jeder Probe aus NJW- und DHW-Zubereitungen nachgewiesen wurden. (A) Das erkannte PHS in NJW-Proben basierend auf ITS2; (B) Das erkannte PHS in NJW-Proben basierend auf trnL; (C) Das erkannte PHS in Warmwasserproben basierend auf ITS2; (D) Das erkannte PHS in Warmwasserproben basierend auf trnL. Beachten Sie, dass jede Spalte eine Stichprobe und jede Zeile ein PHS darstellt. In der Heatmap, die im R-Paket „pheatmap“ (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html) (Version 3.5.2) gezeichnet wurde, stellt die Farbe die relative Häufigkeit von PHS dar (normalisiert). gemäß Spalte) in dieser Probe nachgewiesen. Die Zahl „1“ stellt das PHS dar, das in dieser Probe nachgewiesen wurde, während „0“ das PHS darstellt, das nicht nachgewiesen wurde.

Für die Warmwasserbereitung haben wir 35 PHS entdeckt, die 25 PHMs abdecken, einschließlich der verarbeiteten Kräutermaterialien wie dem gebratenen Baishu. Die Sensitivität der PHMs betrug 69,4 % basierend auf ITS2 (Tabelle 4, Abb. 3C, 4A). Unter den nachgewiesenen PHS aus 18 Proben wurden 15 PHS mit einer durchschnittlichen relativen Häufigkeit von über 0,1 % gefunden, wobei sieben PHS mit einer durchschnittlichen relativen Häufigkeit von über 1 % identifiziert wurden, darunter Angelica sinensis (2,0 %), Asarum sieboldii (1,2 %), Notopterygium franchetii (1,9 %), Notopterygium incisum (1,8 %), Paeonia lactiflora (5,3 %), Paeonia veitchii (2,0 %) und Pogostemon cablin (3,7 %). In allen Proben wurden drei PHS (Clematis hexapetala, Coptis teeta, Paeonia lactiflora) gefunden. Unter ihnen war Paeonia lactiflora in DHW.A-Proben stark angereichert. Die durchschnittliche relative Häufigkeit von Glycyrrhiza uralensis (1,56 %) und Osmunda japonica (1,64 %), die in Proben von DHW.A nachgewiesen wurde, war 1,6-mal höher als in DHW.B-Proben (Glycyrrhiza uralensis (0,94 %) und Osmunda japonica (0,98 %). Während Coptis deltoidei (ein Messwert in DHW.A.III3 erkannt), Ephedra intermedia (drei Messwerte in DHW.A.III2 erkannt), Gastrodia elata (ein Messwert in DHW.A.III3 erkannt) und Rheum tanguticum (drei Messwerte in DHW erkannt wurden). .B.III1) wurden nur in einer Probe nachgewiesen. Bemerkenswerterweise wurden die SHS, die zu Anemone nemorosa (0,31 %) gehören und zur gleichen Gattung wie PHS gehören, in den meisten Proben mit hoher relativer Häufigkeit gefunden, insbesondere in DHW.A.II und DHW.A.III, die währenddessen eingeführt werden könnten Herstellerverarbeitung oder biologisches Experiment.

Phylogenetische Analyse der repräsentativen Arten, die in Trinkwasserproben eine relative Häufigkeit von mindestens 0,1 % aufwiesen. (A) Basierend auf ITS2; (B) Basierend auf trnL. Die Stammbäume der Arten werden in iTOL (https://itol.embl.de/) visualisiert. Der Zweig im Baum stellt die taxonomische Klassifizierung der Arten dar. Das rot markierte Wort bedeutet die vorgeschriebene Kräuterart und der farbige Balken bedeutet die durchschnittliche relative Artenhäufigkeit in den drei Chargen der beiden Hersteller (A, B).

Für NJW wurden sieben PHS aus vier Gattungen mit geringer Häufigkeit nachgewiesen, darunter Codonopsis pilosula, Curcuma kwangsiensis, Curcuma longa, Curcuma phaeocaulis, Nardostachys chinensis, Nardostachys jatamansi und Scutellaria baicalensis (Tabelle 5, Abb. 3B und ergänzende Abb. S2D). Unter ihnen wurde Nardostachys chinensis in allen Proben erfasst, während Codonopsis pilosula und Nardostachys jatamansi nur in einer Probe mit einem Lesevorgang identifiziert wurden, was darauf hindeutet, dass die DNA dieser Arten mit geringer relativer Häufigkeit oder die trnL c/h-Primer schwer zu extrahieren waren waren für die Bestimmung nicht geeignet. Die substituierten Exemplare Astragalus (3,9 %) und Mentha (8,1 %) wurden mit hoher relativer Häufigkeit identifiziert. Was mögliche CHS betrifft, so waren sie in 52 Gattungen verstreut verbreitet.

Bei auf trnL basierenden Warmwasserproben betrug die Empfindlichkeit der PHMs (18 PHMs, 22 PHS) aufgrund seiner komplexen biologischen Bestandteile nur 50 % (Tabelle 6, Abb. 3D und 4B). Von den 22 nachgewiesenen PHS wurden 12 (Tabelle 6) in allen Proben mit einer durchschnittlichen relativen Häufigkeit von mehr als 0,1 % nachgewiesen, mit Ausnahme von Coptis chinensis (0,05 %), bei dem sechs von ihnen 1 % überstiegen, 10 von 22 PHS lagen darunter 0,05 %. Darüber hinaus war die relative Häufigkeit von 22 PHS, die in DHW.A nachgewiesen wurden, höher als in DHW.B. Boswellia Neglecta (6,4 %) war die dominierende Art, gefolgt von Glycyrrhiza uralensis (4,2 %) und dann Coptis deltoidei (2,6 %). Dennoch wurden Ephedra equisetina (12 Lesevorgänge in DHW.A.II3 und 8 Lesevorgänge in DHW.A.III3) und Scrophularia ningpoensis (ein Lesevorgang in DHW.A.I2 und DHW.A.III1) nur in zwei Proben gefunden. Der Grund für diesen geringen PHS-Gehalt könnte in der Verarbeitung bei den Herstellern liegen. Beispielsweise können die Materialien gebratenes Baishu, mit Essig hergestelltes Xiangfu und andere Materialien gekocht oder gebraten werden, bevor sie einem TCM-Präparat hinzugefügt werden, was zu einer Schädigung ihrer DNA führen kann.

Die Analyse der Empfindlichkeit von BYW- und YGW-Proben basierend auf den Biomarkern ITS2 und trnL ist in den Ergänzungstabellen S4–S7 und der Ergänzungsabbildung S2A–B, E–F dargestellt. Vergleicht man die Analyseergebnisse von DHW und NJW, so enthält NJW nur ​​ein vorverarbeitetes PHM (Scutellaria-Extrakt), während DHW sieben vorverarbeitete PHM enthält. Beim Vergleich des Ergebnisses mit dem ITS2-Biomarker wurden mit dem trnL-Biomarker viel weniger Arten identifiziert, was möglicherweise an der DNA-Extraktion, der Primerspezifikation und der Einschränkung der trnL-Datenbank der Genbank liegt. Die drei biologischen Replikate aus diesen Chargen zeigten unterschiedliche PHS-Zusammensetzungen, die sowohl auf ITS2 als auch auf trnL basierten (Abb. 3, Abb. 4, Tabellen 3, 4, 5 und 6, ergänzende Abbildungen S2–S3 und ergänzende Tabellen S4–S7). , die möglicherweise durch DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und High-Through-Sequenzierungstechnologie verursacht werden könnten. Die früheren Untersuchungen von LDW13, YMW14, LXW15 und JQW16 haben dieses Phänomen ebenfalls gezeigt.

Alle erkannten Arten, einschließlich PHS, SHS und CHS dieser vier TCM-Präparate (BYW, DHW, NJW und YGW), wurden auch in den Ergänzungstabellen S8–S15 aufgeführt. Basierend auf dem ITS2-Biomarker haben wir acht, 25, neun und sechs PHMs von BYW, DHW, NJW und YGW nachgewiesen. Der erkannte Anteil an PHMs betrug 100 % für BYW und NJW, gefolgt von DHW (69,4 %) und YGW (66,7 %). Für trnL wurden jeweils fünf, 18, vier und vier PHMs von BYW, DHW, NJW und YGW erkannt. Die maximale Empfindlichkeit der PHMs betrug 62,5 % bei den vier TCM-Präparaten in diesem Experiment. Die Analyse deutete stark darauf hin, dass der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz eine hohe Empfindlichkeit bei der Identifizierung von PHMs von TCM-Präparaten aufweist, insbesondere basierend auf dem ITS2-Datensatz.

Darüber hinaus erstellen wir ein Modell, um die Probe von verschiedenen Herstellern und Chargen zu unterscheiden, aus denen die Proben entnommen wurden. Hier haben wir die euklidischen Abstände für jedes Probenpaar berechnet und die Proben dann entsprechend ihrer Ähnlichkeit gruppiert. Wir haben die Warmwasserbereitung als Fallstudie herangezogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten Warmwasserproben der Hersteller A und B auf der Grundlage der Biomarker ITS2 (Abb. 5A, B) und trnL (Abb. 5C, D) gruppiert waren, was auf eine hohe Ähnlichkeit der herstellerinternen Proben schließen lässt. Die von DHW.A.II und DHW.A.III gekauften Proben wurden mit DHW.B-Proben geclustert, während drei von DHW.AI gekaufte Proben zusammen gesammelt wurden, aber von den anderen Proben entfernt waren (Abb. 5A, B). ). Eine solche Trennung könnte durch das Vorhandensein von SHS wie Senna, Amaranthus, Glycine und CHS wie Arachis, Brassica, Solanum und Oryza verursacht werden. Was NJW betrifft (ergänzende Abbildung S4), wurden die Proben von zwei Herstellern (A & B) auf der Grundlage von ITS2 oder trnL verstreut, während die Proben von jedem Hersteller entsprechend den Chargen (I, II, III) gruppiert wurden zeigte die hohe Konsistenz zwischen den Chargen von NJW-Proben. Die Ergebnisse der Clusteranalyse von BYW- und YGW-Proben (Ergänzende Abbildungen S5–S6) zeigten einen deutlichen Unterschied zwischen den Herstellern sowie eine hohe Ähnlichkeit innerhalb desselben Herstellers.

Vergleich der Ähnlichkeit aller Warmwasserproben von Herstellern innerhalb/zwischen Herstellern basierend auf vorgeschriebenen Kräutermaterialien unter Verwendung euklidischer Abstände. Heatmap-Cluster zeigten die Entfernung aller Proben basierend auf dem Vorhandensein vorgeschriebener Kräuterarten mithilfe hierarchischer Clusterbildung an, und Netzwerkcluster veranschaulichten diese Unterschiede basierend auf den Sequenzierungsergebnissen von ITS2 (A, B) bzw. trnL (C, D). Für die Heatmap (A,C), die im R-Paket „pheatmap“ (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html) (Version 3.5.2) gezeichnet wurde, bedeuten die Farbverlaufsbalken der Abstand zwischen zwei beliebigen Proben, während die rote und die blaue Farbe die beiden extremen Abstände zwischen den Proben darstellen. Für das Netzwerk (B,D), das in Cytoscape (Version 3.7.1; https://cytoscape.org/) visualisiert wurde, repräsentiert jede Kante den Abstand zweier beliebiger Proben mit einem Abstand kleiner oder gleich 5,0 für ITS2 und 4,2 für trnL.

Außerdem wurde eine PCA-Analyse durchgeführt, um die Konsistenz von Proben zweier Hersteller zu untersuchen. Die Proben von DHW.B waren basierend auf den Biomarkern ITS2 und trnL enger geclustert als DHW.A. Basierend auf ITS2 waren die Warmwasserproben aus der Intra-Charge gruppiert, während die Inter-Chargen-Proben nur spärlich verteilt waren. Im Gegensatz dazu waren die Proben von DHW.A basierend auf trnL weit voneinander entfernt (ergänzende Abbildung S7C, D), was darauf hindeutet, dass die Konsistenz der DHW.B-Proben besser war als die von DHW.A. Die Proben aus NJW (ergänzende Abbildung S7E, F) waren stärker verstreut gebündelt als DHW. Das Ergebnis von BYW und YGW (Ergänzende Abbildung S7A, B, G, H) zeigte ebenfalls ähnliche Ergebnisse.

Um die Arten zu untersuchen, die den Unterschied in den Proben zwischen den Herstellern ausmachen, wurde eine LEfSe-Analyse zur Entdeckung von Biomarkern durchgeführt. 13 PHS von DHW.A und vier von DHW.B wurden als vorläufige Biomarker identifiziert (Liste in Abb. 6A). Durch mRMR wurden fünf PHS von DHW.A und zwei PHS von DHW.B ausgewählt. Anschließend verwendeten wir den MEI-Score (Formel (1)), um ihre Leistung zu bewerten (Abb. 6B). Da die Fläche unter der ROC-Kurve von Glycyrrhiza glabra weniger als 0,5 betrug, haben wir diesen Biomarker aus DHW.A entfernt. Daher wurden Coptis chinensis, Ephedra equisetina, Lindera Aggregat und Panax Ginseng als einzigartige Biomarker für DHW.A ausgewählt. Rheum palmatum und Clematis hexapetala wurden als repräsentative Biomarker für DHW.B ausgewählt. Alle verfügen über ein hohes Unterscheidungsvermögen (Abb. 6B), das einzeln oder in Kombination verwendet werden kann, um die Proben der beiden Hersteller zu unterscheiden. Zusätzlich zur ROC-Analyse haben wir auch Genauigkeit und F1-Score verwendet, um die Leistung dieser Biomarker zu bewerten (Ergänzungstabelle S16), die durch das Random-Forest-Modell weiter unterstützt wurden.

Der Unterschied in den Proben der beiden Hersteller (A, B) könnte auf einige diskriminierend verschriebene Kräuterarten von DHW unter Verwendung des ITS2-Biomarkers zurückzuführen sein. (A) Die von LEfSe ausgewählten Legacy-Biomarker; (B) ROC-Kurven zur Visualisierung des MEI-Scores der alten Biomarker nach dem Entfernen redundanter Marker von den beiden Herstellern.

Durch die Erkennung ihrer PHS betrug der erkannte Anteil der PHMs 100 % für BYW und NJW, gefolgt von DHW (69,4 %) und YGW (66,7 % basierend auf ITS2), während er für BYW 62,5 %, 50 %, 44,4 % und 44,4 % betrug. Warmwasser, NJW und YGW basierend auf trnL-Datensätzen (Tabelle 7). Die Empfindlichkeit von ITS2 war in allen TCM-Präparaten besser als die von trnL, aber der trnL-Biomarker konnte auch die PHS von PHMs erkennen, die ITS2 nicht konnte (Boswellia Neglecta und Rehmannia glutinosa). Durch die Kombination beider Biomarker könnte mehr PHS nachgewiesen werden, was zu einem zuverlässigeren (wie bei positiven Nachweisen) Erkennungsergebnis führen würde.

Wie aus dem Venn-Diagramm (Abb. 7) hervorgeht, wurden alle PHMs von BYW nachgewiesen. Was die Warmwasserbereitung betrifft, so betrug das Ergebnis der gemeinsamen Erkennung dieser beiden Regionen 38 PHS, was 28 PHMs abdeckte, was die Identifizierungseffizienz auf 77,8 % erhöhte. In ähnlicher Weise war das Nachweisergebnis von trnL aus der NJW-Präparation eine Teilmenge von ITS2 (100 % Empfindlichkeit). Bei YGW-Proben erhöhte die Kombination dieser beiden Biomarker die Sensitivität auf 77,8 %. Dieses Ergebnis bestätigt auch die hohe Zuverlässigkeit des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes. Anschließend verglichen wir unser Ergebnis mit früheren Studien, einschließlich JQW, LXW, YMW und YYW (Tabelle 8), was die Zuverlässigkeit des Multi-Barcoding-Ansatzes zeigte. Dies deutete auch darauf hin, dass die Komplexität der biologischen Inhaltsstoffe von TCM-Präparaten die ermittelten Ergebnisse ebenfalls negativ beeinflusst hat.

Die spezifischen und gemeinsam verschriebenen Kräuterarten der TCM-Präparate basierend auf ITS2 und trnL. (A) BYW; (B) Warmwasser; (C) NJW; (D) YGW. Die Zahlen unter dem Venn-Diagramm geben die Anzahl der vorgeschriebenen Kräuterarten an, die nur auf der Grundlage von ITS2, trnL und dem Schnittpunkt der beiden erkannt wurden.

Obwohl die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes nachgewiesen wurde, ist die Empfindlichkeit von ITS2 und trnL unterschiedlich. ITS2 zeigte eine höhere Empfindlichkeit als trnL für die Erkennung von PHMs, was möglicherweise auf mehr Datensätze und eine länger konservierte Region von ITS2 zurückzuführen ist. Dennoch ist die Rolle von trnL unersetzlich, da es ITS2 für eine zuverlässigere Identifizierung der PHMs von TCM-Präparaten ergänzen könnte, insbesondere für die Analyse der biologischen Inhaltsstoffe von DHW und YGW in dieser Arbeit.

Wie wir bereits wissen, sind pflanzliche Stoffe die wesentlichsten Bestandteile verschiedener traditioneller Arzneimittel. Es wurden immer mehr Arbeiten zur DNA-basierten Authentifizierung einzelner Kräuter veröffentlicht26,28,29,30,31,32,33, während über einige Anwendungen des Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes für TCM-Präparate berichtet wurde13,34,35, 36.

In dieser Arbeit gelang es dem Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz, die Arten (einschließlich verschriebener, ersetzter und kontaminierter Arten) in einer Probe mit hoher Empfindlichkeit erfolgreich zu erkennen, was auf die gute Universalität der Methode und ihren potenziellen Wert für die tägliche TCM-Überwachung hinweist. Da wir das Vorhandensein aller Arten in einer Probe auf Artenebene bestimmen konnten, deuten diese Ergebnisse auf eine ausreichende Empfindlichkeit dieser Methode bei der Entschlüsselung pflanzlicher Materialien von TCM-Präparaten durch die Authentifizierung der entsprechenden Arten hin. Die Kombination von ITS2 und trnL hat eine hohe Empfindlichkeit erreicht (Minimum: 77,8 %, Maximum: 100 %), was den praktischen Anwendungswert und die hohe Zuverlässigkeit dieses Ansatzes unterstreicht. Insbesondere zeigte der ITS2 eine hervorragende Fähigkeit und Empfindlichkeit bei der Identifizierung pflanzlicher Materialien. Obwohl die Auflösung von trnL geringer war als die von ITS2, könnte es ITS2 für zuverlässigere Ergebnisse verstärken oder ergänzen. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass die Multi-Barcode-Sequenzierung ein effizientes Werkzeug zur Entschlüsselung der Kräutermaterialien verschiedener TCM-Präparate ist.

Beispielsweise wurden für BYW und NJW alle PHMs durch Authentifizierung ihrer entsprechenden PHS erkannt. Die ermittelten PHS der Warmwasserbereitung betrugen 35 (deckten 25 PHMs ab), 22 davon (deckten 18 PHMs ab), basierend auf ITS2 bzw. trnL. Der Vereinigungsdatensatz von ITS2 und trnL hat die Empfindlichkeit für Warmwasserproben von 69,4 % auf 77,8 % erhöht. Allerdings wurden weder auf der Grundlage von ITS2 noch von trnL sechs PHMs in allen Warmwasserproben nachgewiesen. Diese Phänomene können durch verschiedene Vorverarbeitungsvorgänge verursacht werden, beispielsweise durch abgekochte oder gebratene Kräutermaterialien, deren DNA beschädigt oder abgebaut wurde. Wir stellen außerdem fest, dass die Empfindlichkeit der PHMs jeder TCM-Präparationsprobe aufgrund verschiedener Einflussfaktoren wie geologischer Lage, Anbaubedingungen, Klima und anderen Bedingungen unterschiedlich ist.

Der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz könnte dabei helfen, die PHS von PHMs zu identifizieren, solange ihre DNA nicht vollständig beschädigt ist. In zukünftigen Studien muss jedoch noch eine tiefere und umfassendere Verbesserung dieses Multi-Barcode-Sequenzierungsansatzes durchgeführt werden. Eine umfassendere Artendatenbank war erforderlich, da die Zuverlässigkeit der Analyse biologischer Inhaltsstoffe für TCM-Präparate weitgehend von der Referenzdatenbank abhängt2. In unserer zukünftigen Studie können wir mehrere Datenbanken nutzen, darunter die GenBank-Datenbank sowie die tcmbarcode-Datenbank37, EMBL, DDBJ und PDB-Datenbank2, um vollständigere Ergebnisse zu erhalten. Darüber hinaus können weitere Biomarker-Kandidaten zur Beurteilung der Qualität der TCM-Präparation in Betracht gezogen werden.

Erstens könnte der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz ein Versuch sein, die tierischen Materialien zu identifizieren, da die tierischen Materialien immer noch ein wichtiger Bestandteil der TCM sind und oft mit medizinischen Kräutern kombiniert werden, um ihre pharmakologischen Wirkungen zu entfalten38.

Zweitens sind die Analyse chemischer Inhaltsstoffe auf Basis von TLC und HPLC sowie die Analyse biologischer Inhaltsstoffe auf Basis von Multi-Barcode-Sequenzierung relativ unabhängige, aber untrennbare Teile für die Qualitätsbewertung von TCM-Präparaten. TLC und HPLC konzentrieren sich auf chemische Verbindungen, während sich die Multi-Barcode-Sequenzierung auf die Identifizierung von Arten konzentriert. Was die höhere Empfindlichkeit der Artenidentifizierung anbelangt, war die Multi-Barcode-Sequenzierungstechnologie der HPLC und der TLC überlegen. Durch die Kombination der chemischen Methoden mit dem DNA-Barcoding-Ansatz könnte der Nachweis von TCM-Inhaltsstoffen jedoch umfassender sein. Obwohl dieser Gedanke zunächst von unserer Gruppe10 getestet wurde, gibt es noch Raum für weitere Verbesserungen.

Drittens hat uns der Netzwerkpharmakologie-Ansatz einen direkteren Einblick in die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Zielmolekülen verschafft39, der uns einen Einblick in die Optimierung bestehender Medikamente und die Entdeckung neuer Medikamente verschafft, um den Anforderungen zur Bewältigung komplexer Krankheiten gerecht zu werden. Daher sollte die pharmakologische Verwendung bei der Qualitätskontrolle von TCM-Präparaten berücksichtigt werden, insbesondere bei spezifischen Verwendungen, wie beispielsweise der mechanismusbasierten Qualitätskontrolle von YIV-90640. Diese Theorie hat uns auch dazu inspiriert, die möglichen Behandlungen von COVID-19 anhand biologischer Inhaltsstoffe von TCM-Präparaten zu untersuchen41. Die Inhaltsstoffe wie Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma könnten häufig mit dem Ziel von COVID-19 interagieren: ACE219,41. Durch Data-Mining entsprechen die Eigenschaften von acht biologischen Inhaltsstoffen von DHW den Symptomen der klassischen Warm-Krankheit der Syndromdifferenzierung von COVID-19, was sich als wirksam zur Behandlung von COVID-1941 erweisen könnte. In Kombination mit Daten zur öffentlichen Gesundheit könnten diese Informationen zu biologischen Inhaltsstoffen mehr Aufschluss über die Anfälligkeit eines Patienten geben, der diese TCM-Präparate eingenommen hat, insbesondere bei älteren Menschen.

Schließlich werden viele pflanzliche Arzneimittel oral eingenommen42 und sind zweifellos der gesamten Mikrobiota des Magen-Darm-Trakts ausgesetzt, was ausreichend räumlich-zeitliche Möglichkeiten für direkte oder indirekte Wechselwirkungen bietet. Beispielsweise fördert Berberin, der wichtigste pharmakologische Inhaltsstoff des Rhizoms von Coptidis43, die Produktion kurzkettiger Fettsäuren, um die Struktur der Darmmikrobiota zu verschieben, während das schlecht gelöste Berberin44 durch eine durch bakterielle Nitroreduktase vermittelte Reduktionsreaktion in Dihydroberberin umgewandelt und dann wiederhergestellt wurde Die ursprüngliche Form nach dem Eindringen in das Darmwandgewebe45, durch Wechselwirkungen, die mikrobielle Vielfalt im Darm von Mäusen mit fettreicher Ernährung wurde stark verringert46.

Wir glauben, dass diese Bemühungen zur Qualitätskontrolle von TCM-Präparaten zusammenwirken und viel bessere Ansätze für das QC-System der nächsten Generation für TCM-Präparate liefern könnten. Durch die Umgestaltung der symbiotischen mikrobiellen Zusammensetzung könnten wir neuartige Therapiestrategien bereitstellen, um die Umsetzung personalisierter Therapeutika zu beschleunigen.

Insgesamt wurde der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz systematisch mit hoher Universalität, Sensitivität und Zuverlässigkeit untersucht. ITS2 zeigt eine bessere Identifizierungsfähigkeit, trnL konnte jedoch mehrere PHS oder PHMs (wie Boswellia Neglecta und Rehmannia glutinosa) erkennen, die ITS2 nicht konnte, und so ITS2 für zuverlässigere Ergebnisse ergänzen. Durch den Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz haben wir für diese repräsentativen TCM-Präparate zwischen 77,8 % und 100 % PHMs entdeckt, die mit herkömmlichen Methoden, wie morphologischen und biochemischen Mitteln, nicht realisiert werden konnten. Zukünftig könnte dieser Ansatz vielfältigere Sätze von TCM-Präparaten bewerten, was die Identifizierung von TCM-Präparaten auf systematische Weise ermöglicht und die Digitalisierung und Modernisierung der Qualitätskontrolle von TCM-Präparaten beschleunigt.

Der Arbeitsablauf für das TCM-Vorbereitungsanalyseverfahren ist ebenfalls in Abb. 8 dargestellt.

Ein Arbeitsablauf für TCM-Vorbereitungsanalyseverfahren. Dieser Arbeitsablauf umfasst im Wesentlichen vier Teile: (1) Sammlung von TCM-Präparaten: Baizhen Yimu Wan (BYW), Da Huoluo Wan (DHW), Niuhuang Jiangya Wan (NJW) und Yougui Wan (YGW); (2) Probenvorbereitung und Sequenzierung: DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation, Reinigung, Sequenzierung; (3) Qualitätskontrolle: Rohlesefilterung und Artenfilterung; (4) Artenidentifizierung und Probenvergleich: Erkennung vorgeschriebener Kräuterarten (PHS), Erkennung substituierter Kräuterarten (SHS), Erkennung kontaminierter Kräuterarten (CHS), phylogenetische Analyse, PCA-Analyse, Netzwerkanalyse und mikrobieller Umweltindex ( MEI)-Vorhersagemodell zur Beurteilung von TCM-Präparaten.

Es wurden vier TCM-Präparate gesammelt, die jeweils von zwei verschiedenen Herstellern (gekennzeichnet als A und B) mit drei Chargen (I, II und III) gekauft wurden (Ergänzungstabelle S17). Jede Charge wurde mit drei biologischen Replikaten basierend auf ITS2 bzw. trnL implementiert. Daher wurden für das anschließende Experiment 144 Proben verwendet. Hier haben wir ein Beispiel gegeben, um die Benennungsregel von SampleID zu verdeutlichen: DHW.A.I1 bedeutet, dass die DHW-Probe vom Hersteller A gekauft wurde und eines der drei biologischen Replikate (I1) der ersten Charge (I) war.

Für die DNA-Extraktion verwendeten wir eine optimierte Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode (TCM-CTAB)47. Jede Probe (1,0 g) wurde vollständig mit 0,1 M Tris-HCl, 20 mM EDTA (pH 8,0, 2 ml) gelöst. Die gelöste Lösung (0,4 ml) wurde mit Extraktionspuffer (0,8 ml), bestehend aus 2 % CTAB; 0,1 M Tris-HC1 (pH 8,0); 20 mM EDTA (pH 8,0); 1,4 M NaCl und dann 100 μl 10 % SDS, 10 μl 10 mg/ml Proteinase K (Sigma, MO, USA) und 100 μl β-Mercaptoethanol (Amresco, OH, USA) wurden zugegeben und 1 Jahr lang bei 65 °C inkubiert h mit gelegentlichem Wirbeln. Protein wurde durch zweimaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) entfernt. Der Überstand wurde 30 Minuten lang bei –20 °C mit der 0,6-fachen Menge kaltem Isopropanol inkubiert, um die DNA auszufällen. Der Niederschlag wurde mit 75 % Ethanol gewaschen, gelöst und mit TE-Puffer auf 10 ng/μL verdünnt und dann als PCR-Amplifikationsvorlage verwendet. Die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit2.0-Fluorometer quantifiziert.

Die PCR-Amplifikation wurde in einem 50-μL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 1 μL aus TCM-Präparaten extrahierte DNA, 10,0 μL 5 × PrimeSTAR-Puffer (Mg2+ plus) (TaKaRa), 2,5 μL 10 μM dNTPs (TaKaRa), jeweils 0,5 μL, enthielt von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (10 μM), 2,5 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) und 0,5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara, 2,5 U/μL). Zur Amplifikation und Sequenzierung der ITS2-Region wurden die Vorwärtsprimer S2F12 und der Rückwärtsprimer ITS448 (Ergänzungstabelle S18) mit sieben bp MID-Tags (Ergänzungstabelle S19) für die PCR-Amplifikation entwickelt. PCR-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: Vordenaturierung bei 95 °C für fünf Minuten, dann 10 Zyklen bestehend aus 95 °C für 30 Sekunden und 62 °C für 30 Sekunden mit einem Anstieg von –1 °C pro Zyklus, gefolgt von 72 °C für 30 s, danach folgen 40 Zyklen mit 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Der Vorgang endete bei 72 °C für 10 Minuten. Für die trnL-Region wurden auch die Vorwärtsprimer trnL-c und der Rückwärtsprimer trnL-h mit 7-bp-MID-Tags (Ergänzungstabelle S19) für die PCR-Amplifikation entwickelt. Die PCR-Reaktionen wurden gemäß den folgenden Bedingungen durchgeführt: Vordenaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, 10 Zyklen bestehend aus 95 °C für 30 Sekunden und 62 °C für 30 Sekunden mit einem Anstieg von –1 °C pro Zyklus. gefolgt von 72 °C für 30 s; dann folgten 40 Zyklen mit 95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Der Vorgang endete bei 72 °C für 10 Minuten. Für einen besseren Verstärkungseffekt wurde eine Touchdown-PCR48,49 durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf 1 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) gereinigt. Die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit2.0-Fluorometer quantifiziert. Nach der Entfernung einer trnL-markierten BYW-Probe konnte keine Amplifikation durchgeführt werden, was möglicherweise auf eine schwere PCR-Hemmung zurückzuführen war, und einer ITS2-markierten YGW-Probe, die bei der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek der nächsten Generation nicht erstellt werden konnte, 142 Proben (Ergänzungstabelle S20). wurden zur Illumina MiSeq PE300 Pair-End-Sequenzierung geschickt. Die rohen Sequenzierungsdaten für TCM-Präparationsproben wurden in der NCBI SRA-Datenbank mit der Zugangsnummer PRJNA562480 hinterlegt.

Wir haben zunächst FastQC (Version 0.11.7) mit Standardparametern verwendet, um die Qualität der Sequenzierungslesungen zu bewerten. Lesevorgänge aus derselben Stichprobe wurden mit dem QIIME-Skript „join_paired_end.py“ zusammengestellt. Dann haben wir „extract_barcodes.py“ verwendet, um die Double-End-Barcodes aus allen Lesevorgängen zu extrahieren, und „split_libraries_fastq.py“ wurde verwendet, um die Probe entsprechend ihrer Barcodes (Ergänzungstabelle S19) aus den gemischten Sequenzierungsdaten aufzuteilen. Wir haben auch die Parameter „-q 20 --max_bad_run_length 3 --min_per_read_length_fraction 0.75 --max_barcode_errors 0-barcode_type 7“ verwendet, um die Sequenzen mit geringer Qualität vorab zu filtern. Anschließend wurde die Cutadapt-Software (Version 1.14) verwendet, um die Primer zu entfernen (Ergänzungstabelle). S18) und Adapter aus allen Mustern.

Diese Lesevorgänge aller Proben wurden von MOTHUR50 (Version 1.41.0) einer Qualitätskontrolle unterzogen. Per Reads von ITS2, deren Länge < 150 bp oder > 510 bp beträgt, und die Reads von trnL, deren Länge < 75 bp beträgt, wurden entfernt. Danach haben wir die Sequenz, deren durchschnittlicher Qualitätsfaktor in jedem fünfbp-Schiebefenster unter 20 lag, zusammen mit den gesamten Lesevorgängen verworfen. Die Sequenzen, die mehrdeutige Basenaufrufe (N), Homopolymere über acht Basen oder nicht übereinstimmende Primer sowie falsche Barcodes enthielten, wurden ebenfalls aus den ITS2- und trnL-Datensätzen entfernt.

Um jeder Sequenz eine taxonomische Annotation zuzuweisen, haben wir mit BLASTN (e-Wert = 1e−10) in ITS2- und trnL-Datenbanken basierend auf GenBank51 gesucht. Unter allen Ergebnissen haben wir zunächst das PHS mit der höchsten Bewertung ausgewählt, andernfalls haben wir die Art mit der höchsten Bewertung als Zielart für die Sequenz ausgewählt. Darüber hinaus haben wir alle PHS von PHMs in allen Proben manuell durchsucht. Anschließend haben wir die entsprechenden Arten von ITS2- und trnL-Sequenzen mit einer relativen Häufigkeit unter 0,002 bzw. 0,001 verworfen. Die Verdünnungsanalyse wurde mit R52 (Version 3.5.2) unter Verwendung des „vegan“-Pakets durchgeführt, um die Sequenzierungstiefe von TCM-Präparationsproben zu bewerten (Code 1 für Verdünnungsanalyse in ergänzenden Materialien).

Für die Zusammensetzung von PHS haben wir zur Veranschaulichung die Heatmap mit Farbverlauf unter Verwendung des R-Pakets „pheatmap“ (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html) (Version 3.5.2) verwendet Zusammensetzung der PHS basierend auf ihrer relativen Häufigkeit in jeder Probe und verwendete 0 (nicht nachgewiesen) und 1 (erkannt), um den Existenzstatus von PHS in jeder Probe zu beschreiben. Für die Phylogenie der Arten haben wir zunächst ihre phylogenetischen Bäume von NCBI Taxonomy (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi) erhalten. Anschließend haben wir diese phylogenetischen Bäume in iTOL (https://itol.embl.de/) visualisiert. Der innere und der äußere Kreis geben die relative Häufigkeit dieser Art in den Herstellern A bzw. B an. Jeder Kreis hat drei Farben, die die relative Artenhäufigkeit in drei Gruppen darstellen. Der Abstand zwischen zwei beliebigen Proben wurde anhand der euklidischen Distanz basierend auf der Existenz vorgeschriebener Kräuterarten berechnet. Anschließend haben wir den Sample-Sample-Abstand in der Heatmap mit hierarchischem Clustering im R-Paket „pheatmap“ (Version 3.5.2) (https://cran.rstudio.com/web/packages/pheatmap/index.html) visualisiert. Indem wir die Probe als Knoten und den Abstand zweier beliebiger Proben als Kante verwendeten, erstellten wir einen Netzwerkcluster für jedes TCM-Präparat und visualisierten ihn in Cytoscape (Version 3.7.1)53 basierend auf ITS2 bzw. trnL. Es wurde auch eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, um den Unterschied zwischen zwei Herstellern festzustellen (Code 2 für PCA-Analyse in ergänzenden Materialien). Wir haben auch die LDA-Effektgröße (LEfSe)54 verwendet, um ältere Biomarker auszuwählen, und dann eine Merkmalsauswahl mithilfe der Merkmalsauswahl mit minimaler Redundanz und maximaler Relevanz (mRMR)55 durchgeführt, um die Biomarker mit der höchsten Unterscheidungskraft auszuwählen. Um die Leistung der ausgewählten Biomarker sicherzustellen, verwendeten wir auch einen integrierten Index, der als MEI-Score (Microbiome-based Environment Index) definiert ist. Das heißt, das Verhältnis von AUr(Si) und BUr(Sj), definiert als:

wobei AUr(Si) und BUr(Sj) die relative Häufigkeit der i-ten und/oder j-ten ausgewählten Biomarker für die beiden Hersteller A und B bis LEfSe bzw. mRMR darstellen.

Die Analyse der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve56 wurde angewendet, um die Klassifizierungswirksamkeit (MEI-Score) des von verschiedenen Herstellern ausgewählten Biomarkers zu visualisieren. Wir haben auch den Random Forest („Randomforest“-Paket in R) verwendet, um die Leistung der ausgewählten Biomarker zu bewerten, wobei wir die Genauigkeit, den F1-Score und den ROC berücksichtigt haben. Die Daten- und Parametereinstellungen wurden in unserer vorherigen Studie57 ausführlich beschrieben.

Die verschriebenen Kräutermaterialien wurden als die Kräutermaterialien eines TCM-Präparats definiert, die in ChP, abgekürzt PHMs, erfasst sind.

Die vorgeschriebenen Kräuterarten (abgekürzt PHS) waren die ursprünglichen PHM-Arten, jede davon sollte als PHS betrachtet werden.

Die Arten, die mit PHS derselben Gattung angehören, wurden als substituierte Kräuterarten (SHS) definiert. Die von den beiden oben genannten Arten ausgeschlossene Art wurde als kontaminierte Kräuterart (CHS) betrachtet.

Zum leichteren Verständnis der in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen haben wir ein TCM-Präparat, YGW, als Beispiel genommen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Informationen für andere TCM-Präparate wurden in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. In der Ergänzungstabelle S1 haben wir außerdem detaillierte Informationen zu den tierischen und mineralischen Materialien für die vier TCM-Präparate bereitgestellt.

Die Universalität war eine Messung, um zu bewerten, wie der Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz auf ein breites Spektrum von TCM-Präparaten angewendet werden könnte. Hierzu wurden die vier repräsentativen TCM-Präparate ausgewählt.

Die Sensitivität wurde als Verhältnis der Anzahl der erkannten PHMs zur Anzahl der PHMs definiert, die theoretisch identifiziert werden konnten, d. h.

Die Zuverlässigkeit wurde als Anzahl der nachweisbaren PHMs aus den TCM-Präparaten durch den Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz definiert. Je größer die Anzahl nachweisbarer PHMs, desto besser die Zuverlässigkeit.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in der NCBI SRA-Datenbank mit der Zugangsnummer PRJNA562480 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA562480/) verfügbar.

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Diese Arbeit wurde teilweise von der National Science Foundation of China unterstützt [Fördernummern: 81573702, 81774008, 31871334, 31671374]; Nationales Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas [Fördernummer: 2018YFC0910502]. Wir haben außerdem bestätigt, dass dieses Manuskript als Vorabdruck bei BioRxiv58 veröffentlicht wurde, auf den unter https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.29.177188v1 zugegriffen werden kann.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Qi Yao und Xue Zhu.

Schlüssellabor für molekulare Biophysik des Bildungsministeriums, Hubei-Schlüssellabor für Bioinformatik und molekulare Bildgebung, Zentrum für KI-Biologie, Abteilung für Bioinformatik und Systembiologie, Hochschule für Biowissenschaften und Technologie, Huazhong-Universität für Wissenschaft und Technologie, Wuhan, 430074 , Hubei, China

Qi Yao, Xue Zhu, Maozhen Han, Chaoyun Chen, Hong Bai und Kang Ning

Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Toho-Universität, Tokio, 1438540, Japan

Wei Li

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KN und HB haben die Studie entworfen. QY, MH und CC sammelten die Proben und führten die DNA-Extraktion und -Sequenzierung durch. XZ analysierte die Daten und verfasste das Manuskript. KN, BH, XZ und WL haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Hong Bai oder Kang Ning.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yao, Q., Zhu, X., Han, M. et al. Entschlüsselung pflanzlicher Inhaltsstoffe von TCM-Präparaten mit dem Multi-Barcode-Sequenzierungsansatz. Sci Rep 12, 5988 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-09979-z

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Eingegangen: 25. Oktober 2021

Angenommen: 29. März 2022

Veröffentlicht: 09. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-09979-z

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Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie (2022)

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